重慶水豆豉發酵過程中NaCl、還原糖和氨基酸變化與滋味的形成

梁葉星，張玲*，高飛虎，張雪梅，李雪，張歡歡，楊世雄，熊家艷

1(重慶市農業科學院農產品貯藏加工研究所，重慶,401329) 2(重慶西南師范大學出版社有限公司，重慶,400716)

水豆豉，又名姜豆豉，以細菌為主制曲產生酶系分解黃豆中營養物質而制成，是川渝地區的傳統發酵豆制品[1-2]，也是具有重慶本地特色的調味品。其營養全面、含有多種功能因子[3]，具有抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6]、降血糖[7]、降血壓[8-10]等多種生理功能，因此重慶水豆豉有良好的市場前景。

大豆發酵食品具有獨特的滋味和風味，深受廣大消費者的喜愛，消費需求量較大[7]。經過發酵，大豆發酵食品的質地口感、滋味發生了巨大變化，形成了大豆發酵食品獨特的滋味。水豆豉是細菌型豆豉的代表，其參與發酵的主要微生物是枯草芽孢桿菌、乳酸菌、微球菌等[11]。因其獨特的生產工藝、多樣性菌群結構和添加辣椒、姜等調味料，使其成品具有與其他類型豆豉不同的特色滋味。

目前有對我國傳統發酵豆制品滋味的相關研究報道，主要集中在豆腐乳、毛霉豆豉、曲霉豆豉等。研究表明，游離氨基酸和小肽段的構成決定了發酵食品的滋味[12-15]。索化夷等[16]對毛霉豆豉發酵過程中的滋味變化進行了研究，表明氨基酸、還原糖等共同決定了永川毛霉豆豉特有的咸鮮回甘的滋味特點。研究發現腐乳的鮮味除了來源于谷氨酸等游離氨基酸成分，還與小分子肽段的呈鮮作用有一定關系。由于重慶水豆豉通常是在自然條件下發酵而成，導致其產品質量不穩定，不同批次產品風味口感差異大等問題，限制了其產品的推廣和發展。對自然接種重慶水豆豉發酵過程中滋味形成變化規律的研究，有利于評價其感官品質形成機制。目前，水豆豉滋味形成規律的相關研究還未見報道。

本研究對重慶水豆豉在自然發酵過程中各發酵時期氨基酸、還原糖、NaCl、總酸的變化進行了測定，通過分析總結其變化規律，為構建重慶水豆豉感官品質特征參數，制定水豆豉產品質量標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用材料是經重慶地區傳統水豆豉生產工藝自然發酵，取自不同發酵階段的重慶傳統水豆豉。原料是重慶本地大豆。重慶傳統水豆豉生產工藝如下：

大豆篩選→浸泡→瀝干→常壓蒸煮(煮豆水冷藏備用)→冷卻→自然接種發酵(室溫(20±2)℃)→拌料(煮豆水、食鹽含量 12 g/100 g、姜粒、辣椒面、白酒)→入壇發酵后熟(室溫(20±2)℃)→成品。

樣本采集后，樣品用濾紙吸干表面水再經冷凍干燥后研磨過20目篩，密封存放于-18 ℃冰箱中備用。S1～S12分別代表了不同發酵時期的重慶水豆豉樣品。詳見表1。

表1 實驗樣品的編號Table 1 Number of different experimental samples

茚三酮、磺基水楊酸、氨基酸分析儀緩沖液:賽卡姆(北京)科學儀器有限公司；3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic, DNS)，其他化學試劑均為分析純:成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

S-433D氨基酸分析儀，賽卡姆科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；GL-12A高速冷凍離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；UV-6000PC紫外可見光分光光度計，上海元析儀器有限公司；LyoQuest實驗室凍干機，西班牙泰事達科技公司。其他試驗儀器設備為實驗室常用設備。

1.3 方法

1.3.1 還原糖、總糖含量測定

參照索化夷等方法測定[16]。

1.3.2 NaCl含量測定

參照GB/T 12457—2008 規定的間接沉淀滴定法測定[17]。

1.3.3 總酸含量測定

參照GB/T 12456—2008中的酸堿滴定法測定[18]。

1.3.4 總氨基酸和游離氨基酸測定

參照GB 5009.124—2016食品中氨基酸含量的測定[19]。

1.3.4.1 樣品總氨基酸測定前處理

采用常規酸水解-厭氧管充氮密封水解法,略有改動。準確稱取50 mg的樣品于20 mL厭氧水解管中；向水解管中加入10 mL 6 mol/L HCl(含體積分數0.1%苯酚)，將樣品全部浸沒；將水解管放入冰塊中冷凍10 min；充高純氮氣15～30 s，保持水解管豎直，不要將液面濺起，移開氮氣后立即蓋好軟塞，旋緊密封蓋；將水解管置于(110±1)℃恒溫烘箱中水解22 h，水解完成后，冷卻、混勻、過濾、濾渣清洗3次，合并溶液定容到50 mL；準確吸取1 mL水解液，于60 ℃濃縮至干以盡量排除其中的干擾；準確加入2 mL樣品稀釋液，振蕩混勻，用0.22 μm針式過濾器過濾后供上機測定。

1.3.4.2 樣品游離氨基酸測定前處理

稱取1.00 g左右的樣品于錐形瓶中，用50 mL、0.01 mol/L HCl浸提30 min；搖勻后過濾，準確吸取濾液2 mL于離心試管中，加入8%(體積分數)磺基水楊酸2 mL，混勻，靜置15 min；10 000 r/min離心10 min；取上清液，過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.3.4.3 分析條件

流動相經洗脫泵流過，流速0.45 mL/min；茚三酮經衍生泵流過，流速0.25 mL/min。分離柱柱溫為38～74 ℃梯度升溫；反應柱柱溫130 ℃。

1.3.5 感官評價

感官評價在(25±1)℃的感官評價實驗室中進行。由9名經過專業培訓的27～45歲技術人員組成評定小組，統計總分，取平均值。使用各種滋味標準對所有小組成員進行訓練，以便他們能夠準確地描述滋味類型和強度。評定小組成員分別對不同發酵階段的水豆豉產品進行感官評價，評分表如表2所示。

表2 滋味感官評分表Table 2 Sensory evaluation table of flavor

1.3.6 數據分析

數據以均數±標準差(x±sd)表示，采用SPSS 19.0統計軟件進行線性回歸分析，P<0.05表示差異有顯著性，雙變量相關采用Pearson線性相關。

2 結果與分析

2.1 水豆豉發酵過程中NaCl含量的變化規律

水豆豉中的咸味主要來源于NaCl，而NaCl又主要來自于水豆豉后發酵開始時添加的食鹽。由圖1可知，原料大豆中NaCl含量(質量分數)可以忽略不計，直到后發酵開始添加了食鹽后，NaCl逐漸滲透到水豆豉內部，水豆豉中NaCl含量開始逐漸上升，在S9期以后，其質量分數含量快速上升到10%左右，此時水豆豉湯汁中的NaCl含量和水豆豉中的NaCl含量逐漸趨于平衡，NaCl滲入水豆豉的速度減緩，NaCl質量分數最后保持在10.12%，略低于研究報道的貴州水豆豉成品的11.76%[20]，但是已超過了SALLES等報道的Na+的呈味閾值[21]，水豆豉的NaCl含量總體上低于毛霉豆豉[16]和陽江豆豉[20]，這也說明了水豆豉的咸味適中。

圖1 水豆豉發酵過程中NaCl含量的變化Fig.1 The sodium chloride content change during different fermentation stages of Shuidouchi

2.2 水豆豉發酵過程中總酸含量的變化規律

發酵過程中總酸含量高低直接影響水豆豉微生物生產和發酵進程，同時也影響水豆豉成品的滋味形成[22]。由圖2可知，原料在浸泡和蒸煮過程后，酸度保持不變，到了前發酵時期(S4～S5)，酸度開始上升，這是由于大豆經過蒸煮之后，部分細菌得到了一定程度生長，分泌了大量的酶，導致產生酸性代謝物較多[23]。進入到后發酵階段(S6以后)，由于拌料過程中添加了食鹽、姜粒、辣椒面等，同時添加了煮豆水，部分有機酸溶出，導致后發酵開始總酸含量略有下降，進入后發酵第3天(S7)以后，由于此階段乳酸菌等生長，有機酸大量增加，酸度陡然上升，之后酸度值趨于平緩，到后發酵第9天(S10)以后，由于高鹽厭氧發酵產生的酸累積，酸度值又有一定程度上升[4]，直到后發酵末期趨于穩定，最終總酸含量達到了3.86 g/100 g，總酸含量比毛霉豆豉和曲霉豆豉的含量高[22]，水豆豉發酵過程中會產生大量的有機酸，最終形成了水豆豉溫和爽快的酸味口感，這可能是由于形成了乳酸、磷酸等[23]。

圖2 水豆豉發酵過程中總酸含量的變化Fig.2 The total acidity change during different fermentation stages of Shuidouchi

2.3 水豆豉發酵過程中總糖和還原糖含量的變化規律

還原糖是水豆豉中甜味的來源之一，在發酵過程中主要是由微生物分解總糖轉化而來。由圖3可知，在浸泡和蒸煮過程中大豆中總糖溶出了一部分，總糖質量分數由19.62%下降至15.07%。在前發酵階段的最后1天(S5)，總糖含量大幅度下降，進入后發酵階段(S6以后)，總糖含量緩慢下降最后變化趨于平緩，發酵成熟時總糖質量分數下降到7.26%。由圖4可知，在前發酵初期階段，由于微生物利用，還原糖消耗量較大，而總糖轉化為還原糖的量較小，導致在S3期還原糖含量下降。S3期以后，還原糖質量分數上升較快，由1.16%上升到4.19%，在前發酵的最后1天(S5)，由于糖化酶活力增強，還原糖的消耗量略高于生成量，所以還原糖的含量開始下降，進入后發酵階段(S6以后)，由于添加了煮豆水、鹽、酒等，對微生物生長有一定影響，還原糖含量出現小幅度上升，S8期以后還原糖由于微生物的利用而逐漸下降，最后還原糖含量處于較低水平，由于水豆豉中還原糖含量較低，又沒有如毛霉豆豉等在后發酵過程中添加外源糖分，所以水豆豉成品的甜味感覺較弱。

圖3 水豆豉發酵過程中總糖含量的變化Fig.3 The total sugar content change during different fermentation stages of Shuidouchi

圖4 水豆豉發酵過程中還原糖含量的變化Fig.4 The reducing sugar content change during different fermentation stages of Shuidouchi

2.4 水豆豉發酵過程中總氨基酸變化規律

由表3可知，原料黃豆浸泡和蒸煮過程對于水豆豉總氨基酸含量變化影響不大，在前發酵階段(S4～S5)由于微生物分解產生了蛋白酶后水分的

散失，總氨基酸含量略有上升。當進入后發酵階段(S6以后)，由于添加了煮豆水、鹽、姜、辣椒粉等配料，導致其總氨基酸含量下降至28.598 g/100 g。在后發酵過程中總氨基酸含量略有下降，最終含量為22.540 g/100 g，這可能是由于酶作用轉化的游離氨基酸溶于水豆豉湯汁之中。水豆豉成品中檢測出了人體的必需氨基酸，色氨酸由于酸水解過程破壞而未能檢測出含量。水豆豉總氨基酸含量中排名前5的氨基酸分別為谷氨酸(4.369 g/100 g)、亮氨酸(2.141 g/100 g)、天冬氨酸(1.914 g/100 g)、苯丙氨酸(1.492 g/100 g)、丙氨酸(1.406 g/100 g)。5種主要的氨基酸占水豆豉總氨基酸的50.23%。其主要氨基酸與永川毛霉豆豉的主要氨基酸有一定的區別[16]。

表3 水豆豉發酵過程中總氨基酸含量的變化 單位：g/100 g

注：ND表示酸水解過程中被破壞而未檢出。下同。

2.5 水豆豉發酵過程中游離氨基酸含量的變化規律

游離氨基酸是呈味物質，對水豆豉滋味的形成有重要作用。由表4可知，游離氨基酸在發酵前期含量較低，經過酶系作用后，游離氨基酸在前發酵末期(S5)大幅度的增加，進入到后發酵階段(S6以后)，游離氨基酸含量繼續增大，由原料中的3.471 mg/g上升到后發酵末期的峰值42.495 mg/g，增加了11.25倍；但后發酵結束時，游離氨基酸含量有一定幅度的回落，主要原因可能是后發酵結束，一方面部分游離氨基酸溶出到水豆豉湯汁中，另一方面游離氨基酸參與了發酵后期的美拉德反應，導致其含量下降[24]。陳清嬋研究也發現霉菌純種制曲豆豉游離氨基酸含量普遍呈現快速增加，之后有所下降的現象[24]。發酵結束時的水豆豉其游離氨基酸按含量的高低排名前5的為Phe、Leu、Glu、Ala、Val，占水豆豉游離氨基酸總量的55.47%。這與索化夷報道的永川毛霉豆豉的氨基酸特征譜基本一致，區別在于永川毛霉豆豉特征譜中有半胱氨酸，而水豆豉則有丙氨酸[16]。

表4 水豆豉發酵過程中游離氨基酸含量的變化 單位：mg/g

2.6 水豆豉發酵過程中感官評價與有關成分的相關性分析

由表5可知，水豆豉在浸泡(S2)和蒸煮(S3)過程中，對整體的滋味影響不明顯，滋味都處于極弱的水平。前發酵階段(S4)，逐漸產生了鮮味、甜味、酸味等味感，但味感較弱；至前發酵結束，鮮味和酸味出現了明顯的增強，甜味變化不明顯。后發酵階段(S6)開始，由于食鹽的添加，食鹽逐漸滲入水豆豉使其咸味增強。后發酵階段，由于微生物和酶系作用，產生了大量游離氨基酸和有機酸[16]，水豆豉鮮味和酸味明顯增強，苦味和甜味的變化不明顯。對水豆豉發酵過程中的NaCl含量、總酸含量、總糖含量、還原糖含量、氨基酸含量與滋味感官評分進行相關性分析，結果如

表6所示，水豆豉咸味與NaCl含量呈極顯著正相關(P<0.01)，說明后發酵添加食鹽是水豆豉咸味的主要來源。鮮味與游離氨基酸呈極顯著正相關(P<0.01)，表明發酵產生的鮮味游離氨基酸與水豆豉鮮味的形成有關。酸味與總酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)，說明水豆豉酸味的形成與發酵過程產酸有關。甜味與還原糖含量相關性不顯著，甜味與游離氨基酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)，甜味與總糖含量呈極顯著負相關(P<0.01)，表明水豆豉甜味與發酵產生的還原糖關聯度較小，與甜味氨基酸的形成有一定的聯系，這可能是由于水豆豉中還原糖含量較低，其他滋味對于甜味呈味有負面影響，導致感官品評的甜味較弱。

表5 水豆豉發酵過程中感官評分 單位：分

注:a～g不同字母表示各組數據差異具有顯著性(P<0.05)。

表6 水豆豉發酵過程中各參數的相關性矩陣表Table 6 Correlation of parameters during different fermentation stages of Shuidouchi

注：**表示在0.01水平上呈極顯著性相關，*表示0.05水平上呈顯著性相關。

3 討論與結論

水豆豉具有與其他干豆豉不同的特色風味，一方面是由于在后發酵過程中加入了姜粒和辣椒面，這賦予了水豆豉獨特的辛辣滋味，另一方面就是水豆豉在發酵過程中由于微生物作用，導致NaCl、總酸發生變化，對成品咸味、酸味有重要的影響。蛋白質水解形成游離氨基酸與其味感有一定的關聯，尤其是發酵豆制品中的鮮味和苦味物質主要是由于蛋白質水解產生，不同口味的物質在一起，會發生味道的相消、相乘等作用[25-26]，最終共同形成了水豆豉獨特的滋味，其中游離氨基酸的變化對于水豆豉口味形成的作用尤其重要。

研究發現，氨基酸的滋味可以分為鮮味(天冬氨酸、谷氨酸)、甜味(甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸)、甜苦味(賴氨酸、脯氨酸)、苦味(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸)和無味(半胱氨酸)等5大類[27-29]。水豆豉游離氨基酸排名前5的主要氨基酸為Phe、Leu、Glu、Ala和Val。廖順[30]在白腐乳的研究中發現其中肽Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro呈現鮮味，肽Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro呈現鮮味和酸味。索化夷[16]在對永川毛霉豆豉的研究中發現其呈味氨基酸譜帶為Glu+Leu+Cys+Phe+Val。HAN[26]發現青腐乳中，Ala、Ile、Val和Phe為主要氨基酸。不同類型的大豆發酵制品其氨基酸組成差異較大，主要可能與發酵的菌群不同導致蛋白質水解程度不一致有關[31]。

水豆豉游離氨基酸中，鮮味氨基酸占比 13.45%，甜味氨基酸占比22.25%，苦味氨基酸占比59.31%。這與干豆豉的比例相比，鮮味氨基酸占比較低，而苦味氨基酸占比較高[20,32]。謝靚等[33]用電子舌檢測出不同發酵階段豆豉滋味變化，其味覺差異主要體現在苦味、鮮味和咸味上，且苦味回味差別較小，這與我們日常食用豆豉的口感接近。水豆豉食用的口感主要是咸鮮味，略帶酸味，略微有一點苦味和澀味。咸味主要與食鹽添加后的NaCl有關，發酵結束時水豆豉中NaCl質量分數高達10.12%，遠遠高出了咸味的感官閾值1 300 mg/L[21]，所以其咸味的滋味明顯。鮮味主要來源于蛋白質分解產生的氨基酸和短肽，鮮味呈味氨基酸主要是谷氨酸和天冬氨酸，其含量分別達到了3.69、0.931 mg/g，含量雖然不高，但是也能明顯感受到鮮味滋味。水豆豉中酸味是其特征風味之一，發酵結束時其總酸含量高達3.86 g/100 g，使得水豆豉回味中有一定酸的滋味。另外，水豆豉中還略微有一點苦味，可能是苦味氨基酸和酚類物質產生的[16]，但由于咸鮮味感較強而被掩蓋，導致食用時僅能感受到一點后苦味。

綜上所述，水豆豉自然發酵過程中，其滋味主要是在后發酵階段形成。其NaCl在后發酵階段開始呈現逐漸上升后趨于穩定的趨勢；酸度進入后發酵第3天，含量陡然上升，之后酸度值趨于平緩，直到后發酵末期趨于穩定；還原糖含量呈現先上升后下降的趨勢；總氨基酸含量下降，游離氨基酸含量增加了11.25倍。水豆豉發酵完成后按含量遞減順序確定的前5個主要特征氨基酸為Phe、Leu、Glu、Ala、Val，占水豆豉游離氨基酸總量的55.47%。水豆豉中NaCl、還原糖、總酸、呈味氨基酸與后發酵階段添加的辣椒、姜等混合最終形成了重慶水豆豉獨特的鮮咸酸辣略有回甜的滋味。