麥芽品種多重熒光SSR標記指紋數據庫的構建

張志軍，岳杰，尹花

(啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，青島啤酒股份有限公司，山東 青島，266100)

中國啤酒產量連續多年位居世界第一，但啤酒大麥長期依賴進口，主要來自加拿大、澳大利亞、法國等主要大麥產區，主流大麥品種已達20多種。麥芽是大麥經浸麥、發芽、焙焦后制成的，不同品種的麥芽在糖化、過濾、發酵、風味特征等方面存在較大差異。受利益驅使，某些經銷商在高價麥芽中摻入低價麥芽，或者通過麥芽混摻將原本指標不合格的麥芽調配成為“優質麥芽”。麥芽摻假不僅給啤酒企業采購帶來巨大的直接經濟損失，還會對糖化、過濾和發酵過程帶來間接的影響，最終影響啤酒品質的穩定性和一致性。因此，啤酒行業亟需建立一種準確、快速、經濟的麥芽品種鑒定技術，從源頭上保障啤酒原料的純凈性和一致性。

與傳統的形態鑒別法和田間小區種植等農作物種子真實性鑒定技術相比，DNA分子標記具有周期短、重復性好、不受環境影響等優點，已在農作物指紋圖譜構建、遺傳多樣性分析等方面得到了廣泛應用[1-3]。作為第二代分子標記技術，簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)具有多態性豐富、共顯性遺傳、擴增模式簡單等典型特征[4]。國際植物新品種保護聯盟(UPOV)在BMT分子測試指南中，將SSR作為DNA指紋數據庫構建的主要方法。目前，SSR廣泛應用于小麥、玉米、水稻等作物的指紋圖譜構建、遺傳多樣性、品種鑒定分析等[5-12]。但國內外利用SSR進行麥芽品種鑒定方面的研究報道極少，谷方紅等[13]利用5對SSR引物對國內外8個麥芽品種進行了區分，但文中并未給出具體的引物序列信息，品種數量較少，且使用的聚丙烯酰胺凝膠電泳存在分辨率低、無法準確讀取擴增片段大小等缺點[14]，因此無法進行應用。

本實驗室前期基于TP-M13熒光標記結合單重熒光PCR技術可對23個麥芽品種進行區分[15]，但由于毛細管電泳的試劑及引物成本較高，該法在大批量、多批次樣品檢測時存在檢測周期長、成本高等缺點。隨著電泳技術的發展，多重熒光PCR與毛細管電泳多重熒光檢測技術的結合剛好可以解決這一難題。多重PCR(mutiplex PCR)是在同一個PCR反應體系中加入多對引物，針對一個或多個DNA模板擴增出多個目的片段的技術，更加高效、快捷、低成本。因此，在引物組合的設計時不僅要考慮引物在品種區分上的互補性、擴增穩定性，還要具有構建多重PCR體系的潛力。毛細管電泳多重熒光檢測法是采用3對以上的引物組合構建多重熒光PCR反應體系，通過一次毛細管電泳同時檢測3個以上的SSR位點，具有簡便、可靠、低成本及高通量的優點，已在玉米、水稻、棉花等作物的指紋圖譜構建及品種鑒定方面得到廣泛的應用[16-24]。目前，利用毛細管電泳多重熒光進行麥芽品種核心引物篩選、多重PCR體系優化、指紋數據庫構建等方面的研究尚無報道。

本研究基于毛細管電泳多重熒光檢測技術，對前期篩選的引物進行組合設計，根據多重PCR體系優化的結果進行核心引物篩選，并利用核心引物構建國內外主要麥芽品種的指紋數據庫，為麥芽品種和純度鑒定提供一種快速、準確、低成本的高通量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集24種啤酒大麥不同年份的72份樣品作為試驗材料，來源于加拿大、澳大利亞、法國等主要大麥產區，涵蓋當前國際主流大麥品種，樣品分別由加拿大啤酒大麥技術中心(CMBTC)、澳大利亞農作物育種公司(InterGrain)、法國釀造與制麥研究院(IFBM)等機構提供，見表1。

植物DNA提取試劑盒，北京百泰克公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs，美國Sigma-Aldrich公司；GeXP遺傳分析系統試劑，美國Sciex公司；熒光引物，北京英駿生物技術有限公司合成。

1.2 儀器與設備

96通道高通量核酸提取儀，北京百泰克公司；C1000 TouchTMPCR儀，美國Bio-Rad公司；GenomeLabTMGeXP遺傳分析系統，美國Sciex公司；CK1000D高通量組織研磨儀，北京托摩根公司；5430型離心機，德國Eppendorf公司； NanoDrop 2000超微量分光光度計，美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取

另一些有大理想的人則攻破一堵一堵的墻闖了進來，走到這個院落中心，在不知不覺中就變為這里的一分子，然后用那雙毀墻的手，拾起滿地散落的磚頭，把墻重新壘起來，而且砌得又厚又高。

供試的大麥品種通過實驗室制麥得到相應的麥芽樣品，4 ℃保存。取單粒麥芽置于2.0 mL離心管中，加7 mm鋼珠，高通量組織研磨儀1 200 r/min粉碎1 min。采用植物DNA提取試劑盒進行麥芽DNA提取，步驟參照說明書。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測DNA純度和濃度，DNA濃度統一稀釋到20 ng/μL，-20 ℃保存備用。

表1 大麥品種及來源Table 1 Varieties and sources of barley

注：CWB，加拿大小麥局；CMBTC，加拿大啤酒大麥技術中心；InterGrain，澳大利亞農作物育種公司；IFBM，法國釀造與制麥研究院；紅興隆，黑龍江紅興隆農業科學研究院。

1.3.2 引物合成

根據本實驗室前期引物篩選的結果[15,25]，選擇分布于7條染色體的12對多態性豐富、具有單峰或雙峰特征的引物進行合成，正向引物用Alexa Fluor 647(藍)、Alexa Fluor 680(綠)和Alexa Fluor 750(黑)中的一種熒光進行標記，引物序列信息見表2。

1.3.3 PCR擴增

多重PCR反應體系為20 μL，包括4 μL 10×PCR Buffer、4 μL 25 mmol/L MgCl2、4 μL 2 mmol/L dNTP、0.7 UTaqDNA聚合酶、0.03～0.06 μmol/L正向引物和反向引物、樣品DNA 20 ng。多重PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.4 毛細管電泳檢測

取0.5 μL分子質量內標加入39.5 μL甲酰胺緩沖液，混合均勻，加入樣品板中；取1 μLPCR產物加入上樣板中，加石蠟油覆蓋防止揮發；緩沖液板中添加3/4體積分離緩沖液。毛細管電泳進樣電壓2.0 kV，時間30 s，90 ℃變性2 min，分離電壓6.0 kV，分離時間35 min。

1.4 數據分析

PCR產物分離過程中，GeXP遺傳分析系統利用GeneMapper-V3.0軟件對擴增產物的熒光信號強度進行收集、儲存，參照分子質量內標得到圖譜中各片段的大小。通過人工分析將電泳圖譜中的特征峰判讀為對應的等位基因，取3次重復的平均值并四舍五入取整，作為該品種的等位基因大小。電泳圖譜中的單峰(純合型)用X表示，雙峰(雜合型)的主峰和次峰用X/Y表示。利用Power Marker V3.25軟件分析等位基因數、計算多態性信息含量(PIC)，根據各品種等位基因大小進行麥芽品種DNA指紋數據分析。

表2 SSR引物序列信息Table 2 Information of SSR primer sequences

2 結果與分析

2.1 引物多態性分析

對本實驗室前期單重PCR擴增的毛細管電泳圖譜進行分析，剔除雜峰、非特異峰等特殊峰形的引物，選擇等位基因數≥3且具有單峰或雙峰特征的12對引物作為候選引物。利用12對基本引物對24個麥芽品種進行多態性分析，共檢測到135個等位基因，每對引物3～11個，平均為5.63個。引物HVM68多態性最豐富，在165～299bp包含11個等位基因；引物scssr07759和scssr10559多態性最低，僅有3個等位基因。各引物的多態性信息含量變化為0.37～0.82，平均為0.68，表明不同麥芽品種間具有豐富的遺傳多樣性。引物多態性信息，見表3。

表3 SSR引物多態性分析Table 3 Analysis of SSR primer polymorphism

2.2 引物組合設計

本研究初選的12對多態性引物可實現全部24個麥芽品種的區分，考慮到快速、經濟的檢測要求，對引物進行組合設計。基于最少引物鑒定最多品種的指紋圖譜構建原則[10]，從12對候選引物中選擇擴增片段大小差異大、多態性互補的引物進行組合設計，得到4個引物組，每組引物數量3～5對。其中，組合1由3對引物(HVM68、EBmag0007和Bmac755)構成，組合2由4對引物(Bmag382、Ebmac0415、HVM40和scssr 10148)構成，組合3由4對引物(HVM40、HVM68、scssr 10148和Bmag0007)構成，組合4由5對引物(scssr 07759、scssr10559、BMAG0867、Bmag0120和EBmac 755)構成。以組合1為例，3對引物分別進行單重PCR擴增后的指紋圖譜，見圖1。

A-引物Bmac775；B-引物HVM68；C-引物EBmag0007圖1 加麥Copeland在引物組合1的指紋圖譜Fig.1 The fingerprinting of Copeland under combination 1

由圖1可知，利用組合1的3對引物分別對Copeland進行擴增。Bmac755擴增后在146 bp處有一個單峰擴增片段(圖1-A)；HVM68為雙峰特征，分別在223 bp和265 bp處各有一個單峰擴增片段(圖1-B)；EBmag0007在253 bp處有單峰擴增片段(圖1-C)。引物進行組合設計時不僅要考慮引物多態性、擴增穩定性，還要兼顧后期構建多重PCR反應體系的潛力。

2.3 多重PCR體系構建

為進一步提高檢測效率，對4個引物組分別進行多重PCR體系組合試驗。在單重PCR擴增的基礎上逐漸增加引物，分別進行兩重、三重和四重PCR反應。引物進行熒光標記時，擴增片段大小不重合的引物可添加相同熒光標記，擴增片段大小有重合的引物需用不同熒光標記加以區分。通過優化引物濃度、退火溫度等條件，優化多重PCR體系，確保多引物在一個PCR體系中擴增效率相同且彼此不干擾。最后，將多重PCR擴增片段與單重PCR擴增片段進行比對，分析片段大小是否一致、有無非特異峰。

結果表明，組合1、組合2和組合3的多重PCR體系均能成功構建，引物組4中存在非特異擴增，可能是引物間存在相互作用所致。進一步對3個引物組的引物數量、擴增效率、組合擴展能力等因素進行綜合比較，組合1引物數量最少、擴增一致性好，且組合擴展能力最好。以組合1為例，引物EBmag0007和Bmac755之間擴增片段范圍差異在50 bp以上，都用Alexa Fluor 680(綠)熒光標記，3對引物構建的多重PCR反應體系用于品種指紋分析，指紋圖譜見圖2。

A-Copelang；B-Gairdner圖2 引物組合1在麥芽品種Copeland和Gairdner下的多重PCR指紋圖譜Fig.2 The multiple PCR fingerprint of combination from varieties of Copeland and Gairdner

圖2為組合1對Copeland擴增后的指紋圖譜(圖2-A)，EBmac755的單峰擴增片段大小為146 bp，HVM68的雙峰大小為223/265 bp，Bmag0007的單峰大小為253 bp。Gairdner在組合1擴增下的擴增片段大小分別為140 bp、223/259 bp和267 bp(圖2-B)，與Copeland的片段大小完全不同。多重PCR擴增結果與3對引物單獨擴增后的片段大小完全一致，無非特異性峰出現。

2.4 品種指紋數據

在選定的24個麥芽品種中，利用毛細管電泳收集引物組合1的三重PCR在群體中的特異性擴增結果，根據不同引物擴增片段大小進行麥芽品種指紋數據庫的構建，見表4。

3對核心引物在24個麥芽品種中共得到25個等位基因，每對引物的等位基因6～11個不等，平均產生8.3個等位基因，引物多態性較好。其中，引物HVM68多態性最豐富，在165～299 bp包括11個等位基因，EBmag0007在253～285 bp有8個等位基因，Bmac755在142～160 bp有6個等位基因。

表4 24種麥芽在3對SSR引物下的標準指紋數據Table 4 The standard fingerprint data of 24 varieties of malt at 3 pairs SSR primers

注：-表示無。

2.5 品種區分

將每對引物擴增的等位基因按照從小到大的順序排列，采用1～9的個位數字和26個英文字母的組合對指紋數據進行編碼[17]。按照HVM68、Bmac755和EBmag0007的順序排列核心引物，引物代碼分別編號為1、2、3，等位基因按照從小到大的順序分別用a、b、c等英文字母編碼，組合后就構成了代表各品種身份所特有的標準指紋代碼，見表5。

按照核心引物固定的排列順序，加麥Copeland的標準指紋代碼為1h2d3a，澳麥Baudin的標準指紋代碼為1a2e3f，品種間差異明顯。某些品種在同一引物下等位基因相同，需要結合其他引物才能區分。通過已構建的品種指紋代碼，品種區分不僅簡單明了，還能確定品種等位基因所處的具體位置。特征等位基因是指在一定品種范圍內，某一品種區別與其他所有品種所特有的等位基因[10]。Copeland、Meredith、Sebastian、Planet、Commander、墾16 6個品種各具有1個特征引物，Bow和Vlamingh具有2個特征引物。本研究24個麥芽品種中8個品種有11個特征等位基因，僅用1個特征引物即可鑒別相應的品種。

表5 24種麥芽在3對核心引物上的標準指紋代碼Table 5 The SSR standard fingerprint coding of 24 varieties of malt at 3 pairs SSR primers

表6 24種麥芽品種區分的等位基因組合Table 6 The allele-based combination for identification of 24 malt varieties

由表6可知，不同引物彼此組合后在品種區分效率上差異較大。2對引物的組合中，HVM68與EBmag0007組合后可區分13個品種，區分率54.2%；HVM68與Bmac755組合后可區分19個品種，區分率79.2%，說明不同引物的組合之間鑒定效率差異較大。現有引物的等位基因組合中，5種麥芽Metcalfe、Kendall、Latrobe、Compass和Prestige的等位基因相似度較高，需要3對引物才能完全區分，區分難度相對較大。

3 討論

多年來，麥芽品種混摻已成為麥芽和啤酒行業內的潛規則，給啤酒企業的麥芽采購和啤酒生產帶來巨大的經濟損失和嚴重的質量風險。由于摻假麥芽與純度合格的優質麥芽的市場價格相同，摻假麥芽的獲利空間大，那些誠實、合規的企業獲利空間越來越小，導致劣幣驅逐良幣。只有建立一種快速、準確、低成本的麥芽鑒定方法，才能從根本上解決麥芽摻假的行業困局，促進啤酒和麥芽行業更加健康有序的發展。

基于最少引物鑒定最多品種的指紋圖譜構建原則[10]，但引物篩選工作量大且繁瑣，大部分引物表現存在著缺陷，影響引物的實用性，能篩選出一對綜合表現良好、多態性高、重復性好的引物較不易[7]。如馮飛等[26]利用19對條帶清晰、多態性穩定的SSR引物構建了122份向日葵材料的SSR指紋圖譜，董志剛等[27]利用15對SSR標記建立16份葡萄種質的分子指紋圖譜，包溫泉等[28]利用9對SSR引物可實現16個仁用杏品種的DNA指紋圖譜。本研究對初選的12對多態性引物進行組合設計，得到4個引物組也能實現24個麥芽品種的區分，每組引物數量僅3～5對。

在毛細管電泳多重熒光檢測技術應用方面，DANIEL等[29]利用10對SSR引物構建的兩個五重PCR擴增體系，對31個加拿大種植的啤酒大麥品種進行區分；夏春蘭等[16]認為，與普通熒光檢測技術相比多重PCR熒光檢測技術的檢測效率提高了5.5倍，與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比效率提高了11倍。本研究基于3對核心引物構建的多重熒光PCR體系，與單重熒光PCR擴增相比檢測效率提高了3倍，電泳檢測成本降低75%，結果與上述研究基本一致。

隨著品種數量的進一步增加，核心引物組合的區分能力可能會逐漸減低，某些品種的指紋圖譜可能完全相同，無法區分。考慮到實際檢測中樣品數量大、品種親緣關系相近的問題，權衡準確、快速、經濟等要求，可采取“核心引物+擴展引物”的組合模式[30]。在進行麥芽純度鑒定時，首先選用3對核心引物進行區分，其他9對引物可作為擴展引物，核心引物無法區分時再啟用擴展引物。此外，現有的三重PCR體系中僅用到綠色和黑色2種熒光，藍色熒光標記尚未使用，如有新引物可用藍色熒光標記，為今后進行四重、五重PCR研究、擴展品種鑒定能力提供了可能。

4 結論

本研究對前期篩選的12對引物進行組合設計，并進行多重PCR體系優化，將3對引物(HVM68、EBmag 0007和Bmac755)確定為核心引物，并對24個麥芽品種進行指紋圖譜構建，實現不同麥芽品種的快速區分。與單重PCR需要進行多次毛細管電泳分析相比，多重PCR僅需一次毛細管電泳即可實現全部麥芽品種的同步鑒定，電泳檢測時間和成本顯著降低，為啤酒企業的大麥、麥芽質量監控提供有效的檢測技術。