徽州呈坎羅氏毛豆腐營養成分及浸提液抗氧化活性的研究

胡曉倩,李長江,吳永祥,祁路路,王玉芹,黃輝,韓婷婷

1 (黃山學院 生命與環境科學學院,安徽 黃山, 245041) 2 (黃山學院 化學化工學院,安徽 黃山, 245041)

徽州呈坎羅氏毛豆腐是原產地保護的著名大豆發酵食品，“呈坎羅氏”是其自主品牌商標，入選非物質文化遺產，是“世博會”指定產品和“舌尖上的中國”報道產品，是不添加任何添加劑及防腐劑的綠色、獨特、地方性和傳承性的產品。

過量自由基能引發組織細胞病變，組織細胞病變可引起各種疾病發生和加速機體衰老，通過阻斷過氧化鏈式反應減少或消除自由基，可預防或減少疾病的發生，且具有防癌、抗癌的作用[1]。體內過剩自由基能夠被具有抗氧化活性的物質有效的清除，對具有抗氧化活性功能的食品的研究極具現實意義。

目前學術界對于毛豆腐的研究主要集中在毛豆腐發酵技術與化學成分的分析[2]，對毛豆腐的抗氧化功能研究甚少。本實驗通過對非遺產品徽州呈坎羅氏毛豆腐基本營養成分的檢測、浸提液的制備及其體外抗氧化活性(總還原力及對自由基清除能力)的測定，旨在為非遺產品徽州呈坎羅氏毛豆腐功能機制研究及功能產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

1.1.1 材料

非遺產品徽州呈坎羅氏毛豆腐，由安徽省黃山市呈坎羅氏毛豆腐工作坊提供。普通毛豆腐1和普通毛豆腐2，購自安徽省黃山市陽湖菜市場的兩家不同商家。

1.1.2 試劑

乙醇、甲醇、磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl，pH 8.2)、鄰苯三酚、HCl、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Vc、過硫酸鉀等，均為分析純。實驗用水均為蒸餾水。

1.1.3 儀器與設備

TDL-5臺式低速離心機,上海安亭科學儀器廠; HH-S恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市醫療儀器有限公司; YP3001N電子天平,上海精密科學儀器有限公司; pH酸度計,梅特勒-托利多儀器上海有限公司; SX4-10箱式電阻爐,上海樹立儀器儀表有限公司; LPCD-E3000電熱恒溫鼓風干燥箱,上海龍躍儀器設備有限公司; FL-1電子萬用爐,北京市永光醫療儀器有限公司; Microfuge 20R臺式高速冷凍離心機,貝克曼庫爾特商貿中國有限公司; SpectraMax-190型全波長酶標儀,美國Moleculear Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛豆腐營養成分檢測

呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐，同時進行以下營養成分指標的檢測，以示比較。實驗數據均為平行測定3次取平均值。

(1)pH值測定

pH酸度計測定。

(2)水分測定

按照食品安全國家標準食品中水分測定的標準和方法(GB/T 5009.3—2010)進行測定[3]。

(3)灰分的測定

按照食品安全國家標準食品中灰分測定的標準和方法(GB/T 5009.4—2016)進行測定[4]。

(4)蛋白質含量的測定

用BCA法蛋白含量測定試劑盒進行測定。

(5)可溶性總糖含量的測定

采用蒽酮比色法測定[5]。以標準品葡萄糖含量X為橫坐標，A620為Y縱坐標，繪制標準曲線并得線性回歸方程Y=2.123 7X-0.001 2，R2=0.994 1，葡萄糖標準品在10～80 μg/mL時與A620呈良好的線性關系。將待測樣品溶液測得的吸光值代入葡萄糖標準曲線中，計算樣品溶液的含糖量，并換算為100 g毛豆腐樣品中的總糖含量表示(g/100 g)。

(6)Vc含量的測定

采用2，4-二硝基苯肼比色法測定[6]。以標準品Vc含量X為橫坐標，A500為Y縱坐標，繪制標準曲線并得線性回歸方程Y=0.011 3X-0.0013，R2=0.996 7， Vc標準品在1.6～8 μg/mL時與A500呈良好的線性關系。將待測樣品溶液測得的吸光值代入Vc標準曲線中，計算樣品溶液的Vc含量,并換算為100 g毛豆腐樣品中的Vc含量，mg表示(mg/100 g)。

1.2.2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液單因素設置和制備

將呈坎羅氏毛豆腐研磨成糊狀，精準稱取5、10、 20 g置于燒杯中，加入100 mL蒸餾水作為溶劑，攪拌均勻后靜置60 min，得單因素料液比的1∶20、1∶10、 1∶5三個水平；再在單因素浸提溫度的35 ℃(接近體溫)和100 ℃(接近烹飪的蒸煮溫度)這2個水平的恒溫水浴鍋中浸提60 min，室溫下靜置冷卻至室溫，2 000 r/min離心15 min，再在4 ℃, 14 000 r/min離心30 min，取上清液為浸提液，置4 ℃冷藏備用。每個水平的實驗均重復3次。

1.2.3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的可溶性固形物含量測定

采用干燥法測定[7]。選取干燥稱量容器，稱重后將重量記為W0。加入1 mL浸提液(按照1.2.2制備)，稱重后記為W1。90 ℃烘30 min，然后將烘箱溫度調為105 ℃，烘1.5 h后拿出，再放入干燥器中干燥30 min，稱重后記為W2(一定要達到恒重，即質量差值小于0.2 mg)。每個水平浸提液均平行做3份。按照公式(1)計算可溶性固形物含量。

(1)

1.2.4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液體外抗氧化活性檢測

(1)呈坎羅氏毛豆腐浸提液總還原力的測定

采用普魯士藍法[8]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價浸提液的總還原力。每個水平浸提液重復3次。

(2)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對超氧陰離子清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[9-11]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價浸提液對超氧陰離子的清除能力。每個水平浸提液重復3次。

(3)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對羥自由清除能力的測定

采用水楊酸捕獲羥自由基法[12-13]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價浸提液對羥自由基的清除能力。每個水平浸提液重復3次。

(4)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對DPPH自由基清除能力的測定

采用DPPH法[14-16]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價浸提液對DPPH自由基的清除能力。每個水平浸提液重復3次。

(5)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對ABTS自由基清除率的測定

采用ABTS法[17-18]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價浸提液對ABTS自由基的清除能力。每個水平浸提液重復3次。

1.2.5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液體外抗氧化活性數據統計學分析

采用SPSS18.0統計分析軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan′s多重比較法分析樣本間的差異顯著性，P<0.05認為樣本間具有顯著差異。所有實驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的營養成分檢測結果

營養成分檢測結果見表1，普通毛豆腐的pH值波動較大，呈現不穩定的狀態，而呈坎羅氏毛豆腐的pH值很穩定，呈弱堿性。呈坎羅氏毛豆腐的水分、灰分、可溶性總糖和Vc含量都略高于普通毛豆腐。呈坎羅氏毛豆腐的蛋白質含量達到20.830 gmL，遠高于普通毛豆腐的蛋白質含量。相比普通毛豆腐，徽州呈坎羅氏毛豆腐具有更高的營養價值。

表1 呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的營養成分檢測結果Table 1 The results of nutritional components in Luo’s hariy toufu and the oridinary hariy toufu

2.2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的總還原力

還原能力強的物質因其化學本質為還原劑，將會是良好的電子供體，研究發現總還原力與物質的抗氧化活性呈正相關[19]。一般情況下具有較強還原能力的物質能夠把Fe3+還原成Fe2+，根據顯色反應可以判斷其還原程度，反應后的吸光度越大的物質其還原能力越強[20]。呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc的總還原力實驗測定的A700數值如表2所示。

由表2可知，2個單因素的不同水平得到的浸提液的總還原力具有統計學顯著差異(P<0.05)。料液比降低，可溶性固形物含量增加，總還原力增加；相同的料液比，浸提溫度從35 ℃(接近體溫)升高到100 ℃(接近食品加工蒸煮溫度)，可溶性固形物含量和總還原力均明顯增加。以Vc為參照，料液比同為1∶5，35 ℃的浸提液的總還原力，與25 μg/mL的Vc相當，而100 ℃浸提液的總還原能力明顯提升，與50 μg/mL的Vc相當。實驗結果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液具有一定的抗氧化能力，浸提溫度的升高，有利于浸提液可溶性固形物中活性成分的有效釋放并促進總還原力的提升。

表2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的總還原力Table 2 The reducing power of the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)；“-”表示未檢出。

2.3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對超氧陰離子自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc對超氧陰離子自由基的清除率如表3所示。由表3可知，2個單因素的不同水平得到的浸提液，其對超氧陰離子自由基的清除率有統計學顯著差異(P<0.05)。浸提液對超氧陰離子自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現增加趨勢。以Vc為參照，實驗中的不同浸提液，對超氧陰離子均有較好的清除能力，基本高于120 μg/mL的Vc，而且，料液比為1∶5的100 ℃浸提的毛豆腐浸提液，清除能力已超過200 μg/mL Vc溶液的清除能力，說明呈坎羅氏毛豆腐浸提液對超氧陰離子有較好的清除能力。

表3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對超氧陰離子自由基的清除率Table 3 The scavenging activity of the different extracts of Luo's hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

2.4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對羥自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc對羥自由基的清除率如表4所示。由表4可知，2個單因素的不同水平得到的浸提液，其對羥自由基的清除率有統計學顯著差異(P<0.05)。浸提液對羥基自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現增加趨勢。以Vc為參照，實驗中的不同浸提液，對羥自由基均有較好的清除能力，介于120～600 μg/mL的Vc，料液比為1∶5的100 ℃浸提液對羥自由基的清除效果，已極大超過了200 μg/mL的Vc溶液的清除效果，與600 μg/mL的Vc溶液清除效果大致相同。實驗結果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液對羥自由基有較強的清除能力。

表4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對羥自由基的清除率Table 4 The scavenging activity of ·OH in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

2.5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對DPPH自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc對DPPH自由基的清除率如表5所示。由表5可知，兩個單因素的不同水平得到的浸提液，其對DPPH自由基的清除率有統計學顯著差異(P<0.05)。浸提液對DPPH自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現增加趨勢。以Vc為參照，料液比為1∶5的35 ℃的浸提液對DPPH自由基的清除效果，與20 μg/mL Vc溶液的清除效果相當，而100 ℃浸提的毛豆腐浸提液對DPPH自由基清除能力，就明顯高于20 μg/mL Vc溶液，說明呈坎羅氏毛豆腐浸提液對DPPH自由基有一定的清除能力。

表5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對DPPH自由基的清除率Table 5 The scavenging activity of DPPH· in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)；“-”表示未檢出。

2.6 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對ABTS自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc對ABTS自由基的清除率如表6所示。由表6可知，2個單因素的不同水平得到的浸提液，其對ABTS自由基的清除率有統計學顯著差異(P<0.05)。浸提液對ABTS自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現增加趨勢。以Vc為參照，實驗中的不同浸提液，對ABTS自由基均有較好的清除能力，介于40～200 μg/mL的Vc，料液比為1∶5的100 ℃浸提的毛豆腐浸提液對ABTS自由基的清除效果與200 μg/mL的Vc溶液相當。實驗結果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液對ABTS自由基有較好的清除能力。

表6 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對ABTS自由基的清除率Table 6 The scavenging activity of ABTS· in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

3 結論

在眾多的植物性蛋白質中，只有大豆蛋白能提供所有的必需氨基酸，是聯合國糧農組織指定的優質蛋白，成為越來越重要的植物蛋白資源[21-22]。本研究綜合對比分析了徽州呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的基本營養成分(pH、水分、灰分、蛋白質含量、總糖含量、Vc含量)，結果顯示徽州呈坎羅氏毛豆腐蛋白質、Vc以及可溶性總糖的含量高于普通毛豆腐，具較高的營養價值。

Vc是重要的水溶性捕捉型抗氧化物，能清除活性氧自由基，具抗衰老、預防心血管疾病等多種生理功能，促進人體正常生理代謝的平衡[23-24]。吳非等的研究顯示，傳統霉菌發酵豆制品具有較高的抗氧化活性[25]。徽州毛豆腐是將來自于大豆蛋白的豆腐自然接種毛霉菌，發酵4～7 d而成。在發酵過程中因微生物及酶的作用，在毛豆腐中產生了許多生物活性物質[2, 26]。本實驗以不同浸提溫度與料液比為因素水平，研究了徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液的抗氧化活性，以闡明不同加工方式對其功能活性的影響。結果表明，徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液具有較好的總還原力和對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力。不同浸提溫度與料液比對徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液抗氧化活性的影響顯著。相比35 ℃(接近體溫)的浸提液，100 ℃(接近食品加工蒸煮溫度)的浸提液，其體外抗氧化能力明顯增強。本研究首次闡明了非遺產品徽州呈坎羅氏毛豆腐的功能活性，并為其合理的加工方式提供了技術參考，為其成為可開發的抗氧化功能食品提供了理論依據。下一步將對100 ℃浸提的毛豆腐浸提液進行主要活性成分分析，以明確抗氧化活性的主要成分。