酸奶發酵和冷藏過程中品質評價及主要風味成分變化分析

魏光強，陳越，卓加珍，趙存朝，王雪峰,2*，黃艾祥

1(云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明，650201) 2(云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南 昆明，650201) 3(云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明，650223)

酸奶是指以鮮牛乳為主要原料，經均質、殺菌處理后接種嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌等有益乳酸菌發酵而制成的具有特殊風味的乳制品[1-2]。酸奶的口感和風味與酸度、pH、持水力、黏度、氨基酸和脂肪酸等密切相關，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在牛乳發酵過程中能促進牛乳的酸化和成形，乳酸可降低胃液pH值，抑制腸道內有害菌的生長，有益人體健康。乳中脂肪酸含量一般在3%～5%，但發酵后乳中脂肪酸含量比生乳有所提高，發酵過程乳中蛋白質水解還會產生一些更易吸收的生物多肽和氨基酸[3]，以及其他具有生物活性的物質[4]，酸奶中的氨基酸不僅有益腸道健康，同時在轉氨酶作用下可伸展成線性的酪蛋白分子，凝結成具有網絡結構的凝膠狀態，使酸奶具有一定的黏度，進而影響著酸奶的組織狀態和外觀[5-10]。

李宏軍等[6]研究了齊齊哈爾市4個品牌酸奶在不同貯存溫度下酸度和pH值的變化；朱秋勁等[7]研究了酸奶的加工貯藏過程中酸度、黏度和色度的變化；郭清泉等[11]研究了普通酸奶制品在12 ℃貯存時酸度和發酵劑菌數量的變化趨勢；李云龍等[8]研究了酸奶在貯存過程中脂肪酸含量的變化；王芳等[9]研究了低溫酸奶儲存過程中氨基酸含量變化。現有研究多集中在酸奶貯藏過程的理化指標、微生物數量及一些風味成分變化，而對酸奶從生產加工到貯藏整個過程的理化指標、乳酸菌活菌數及主要風味成分變化的研究較少。本研究主要對酸奶從發酵到冷藏整個階段的pH值、酸度、持水力、黏度等理化指標、乳酸菌活菌數及氨基酸、脂肪酸等風味成分含量進行測定分析，以期為酸奶及發酵乳制品的研發、生產、品質評價分析等提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料乳

鮮牛乳，云南昆明奶牛牧場提供。

1.1.2 菌種

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，CICC 6063)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，CICC 6064)：由中國工業微生物菌種保藏中心提供。菌株使用前進行活化， 4 ℃冰箱儲存備用。

1.1.3 試劑

焦性沒食子酸、乙醚、無水硫酸鈉、苯酚、NaCl(分析純)：天津市風船化學試劑科技有限公司；乙腈、甲醇(色譜純)：德國默克股份兩合公司；正庚烷(色譜純)：上海金貿泰化工有限公司；氨基酸標準溶液：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HPX-9272ME恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司；DW-HL398S超低溫冰箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶機，北京世紀陽光科技發展有限公司；PHSJ-3F型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；DV-79B數字式黏度計，上海尼潤智能科技有限公司；MD2OO-2氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent 7890A型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸奶加工工藝

原料乳(驗收，冷貯)→預熱(50～60 ℃)→均質(8～10MPa均質)→滅菌(巴氏殺菌65 ℃，30 min)→冷卻(30～45 ℃)→接種(嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1∶1)→發酵(38～42 ℃，10 h)→冷藏后熟(2～4 ℃)。

1.3.2 酸奶發酵、冷藏過程中理化指標分析

發酵階段從發酵6 h(F6)開始，每隔2 h測定1次直至發酵10 h(F10)結束完成發酵階段的測定，冷藏階段1～6 d(S12～S144)每隔12 h對各理化指標測定1次，做3組平行重復。

1.3.2.1 黏度和持水力測定

持水力參照HASSAN的方法測定；黏度使用DV-79B數字式黏度計直接測定。

1.3.2.2 酸度、pH值測定

酸度測定采用酸堿滴定法；pH值測定采用PHSJ-3F型pH計直接測定。

1.3.2.3 乳酸菌活菌數測定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》。

1.3.3 酸奶發酵、冷藏過程中氨基酸含量分析

1.3.3.1 樣品處理及其衍生

參照王逍君等[10]、王雪峰等[11]的方法并進行修改。準確稱取2.0 g酸奶，置于20～30 mL安瓿瓶中，加入10 mL含0.1%(質量分數)苯酚的6 mol/L HCl，振搖使酸奶溶解或均勻分散于溶液中，將安瓿瓶置于-20 ℃冰箱中冷凍3～5 min后取出充氮后用噴燈熔封并置于110 ℃左右的烘箱中水解24 h，取出冷卻，從中取水解液1 mL置濃縮儀濃縮至干，加入1 mL 0.1 mol/L稀HCl溶解后用0.45 μm濾膜過濾。然后準確量取氨基酸標準溶液及樣品水解液200 μL，分別置于1.5 mL離心管中，往每個離心管中準確加入正亮氨酸內標溶液20 μL，每個離心管中分別加入三乙胺乙腈溶液100 μL、異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷400 μL至各離心管，振搖后放置10 min，取下層溶液(PTC-AA)，用0.45 μm針式濾器過濾，取濾液200 μL加800 μL水稀釋，搖勻，待測。

1.3.3.2 高效液相色譜法(HPLC)測定氨基酸含量

樣品進行預處理后按照如下方法進行測定。Venusil AA氨基酸分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；色譜條件：柱溫40 ℃；進樣量：10 μL；波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；流動相A：在1 850 mL的蒸餾水中加入15.2 g無水乙酸鈉進行溶解，溶解后用冰醋酸將pH值調至6.5，最后加140 mL乙腈，混勻，用0.45 μm濾膜過濾；流動相B：80%乙腈溶液；洗脫梯度如表1所示。

表1 流動相梯度 單位：%

氨基酸質量濃度和總氨基酸含量如公式(1)和公式(2)。

(1)

式中:f1為樣品溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積；f2為混合氨基酸標準溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積；C為氨基酸對照品質量濃度，μg/mL。

(2)

式中:P為氨基酸質量濃度，g/mL；V為樣品溶液的定容體積，mL；W為樣品質量，g。

1.3.4 酸奶發酵、冷藏過程中脂肪酸含量分析

1.3.4.1 樣品預處理

參照鄭玉梅等[8]的方法進行樣品預處理。

1.3.4.2 氣相色譜法(GC)測定脂肪酸含量

樣品進行脂肪提取、皂化和甲酯化預處理后按照如下方法進行測定。CD-2560毛細管柱(100 mm×0.25 mm×0.20 μm)；氣相色譜檢測條件：初始溫度130 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫到240 ℃，保持20 min，進樣口溫度250 ℃，分流比100∶1，氫火焰離子檢測器溫度為240 ℃，載氣為高純度氦氣和氫氣，流速為1 mL，進樣量為1.0 μL。

數據處理：以保留時間定性，面積百分比法定量(歸一化法)計算如公式(3)所示：

(3)

式中:Ai為第i個組分的峰面積；∑Ai為第i個組分的所有峰面積之和。

1.4 數據處理及統計分析

每個樣品至少3次重復數據，以平均值(AV)±標準差(SD)表示。通過SPSS 17.0軟件對數據進行方差顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 酸奶發酵、冷藏過程中理化指標分析

2.1.1 酸奶發酵、冷藏過程中黏度和持水力測定

黏度是評價酸奶口感的一個重要指標，黏度的變化與其酸度變化、蛋白質凝膠的形成直接相關，并影響酸奶的質構和穩定性，在乳發酵的過程中與蛋白質相互作用，改變了酪蛋白的結構，從而增加酸奶的黏度。酸奶發酵、冷藏過程中黏度和持水力的變化如圖1所示。

圖1 酸奶發酵、冷藏過程中黏度和持水力變化Fig.1 Changes in viscosity and water holding capacity of yogurt during the fermentation and refrigeration注：F表示發酵期；S表示冷藏期。下同。

由圖1可以看出，在發酵初期黏度變化趨勢較為緩和，原因在于此時處于發酵初始階段，pH值較高，酪蛋白溶解度增大，黏度值低，且牛奶中包含的天然緩沖體系也發揮了一定作用；隨著發酵時間的延長，pH值降低，黏度增加，原因是pH值較低，解離下來的酪蛋白重新聚合形成具有網絡結構的穩定凝膠狀態，溶解度降低，黏度增大[12]。冷藏初期黏度顯著增加，在冷藏84 h達到最高值為508.33 MPa·s，原因是在冷藏初期pH值低，酪蛋白繼續聚合，另外在進入冷藏階段后溫度迅速降低，熱運動變得較為緩慢，也促進酸奶黏度增大[12]。冷藏后期，由于發酵產酸，導致乳中微小蛋白質亞膠體分子團改變，親合連接作用減弱，進而導致乳膠體的剛性降低，蛋白質網絡變得松散，酸乳黏度降低[13-14]，第6天時黏度為461.33 MPa·s。

酸奶從發酵至冷藏階段的持水力和黏度變化在趨勢上成正比，這是因為酸奶的持水能力是由凝乳微粒的表面積與凝乳微粒的重量之比決定的，這個比值越高，持水力就越大[15]。發酵階段的持水力變化不大，發酵初期酪蛋白結構遭到破壞使溶解度增大，但同時酪蛋白與水之間存在的靜電作用又使酸奶具有一定的持水力[15]；從發酵至冷藏階段持水能力顯著增加，在冷藏84 h達到最高值為55.98%，可能原因是此時解離的酪蛋白重新聚合形成具有網絡結構的穩定凝膠狀態，酪蛋白之間的空隙很好地包裹了水分，所以持水力增加[16-17]，之后又緩慢下降的原因是高酸度情況下對酪蛋白凝膠結構有一定的破壞造成持水力降低、乳清析出[18]。

2.1.2 酸奶發酵、冷藏過程中pH值和酸度測定

pH值和酸度與酸奶的風味和品質密切相關，pH值和酸度變化會導致酸奶的酸味太重、乳清沉淀析出、感官質量下降，使酸奶的風味發生較大變化[19]。酸奶發酵、冷藏過程中pH值和酸度變化如圖2所示。

圖2 酸奶發酵、冷藏過程中pH值、酸度變化Fig.2 Changes in pH value and acidity of yogurt during the fermentation and refrigeration注：RM代表發酵初期。

由圖2可知，F6～F10 h是乳酸菌產酸的主要時期，pH值由5.46下降到3.67，酸度由73.53oT升高到87.77oT，差異顯著(P<0.05)，其主要原因是保加利亞乳桿菌分解蛋白產生的多肽和氨基酸刺激嗜熱鏈球菌將乳糖代謝成乳酸，還有產生的各種氨基酸對酸奶pH值的降低也有一定的影響[20]。冷藏過程中酸奶的pH值平緩下降，差異不顯著(P>0.05)，原因是乳酸菌的繼續生長繁殖消耗剩余的乳糖產生乳酸，進一步酸化[21]。冷藏期間的酸度在85.97～94.13oT，達到GB 5413.34-2010中酸乳制品規定的酸度值(70～110oT)。

2.2 酸奶發酵、冷藏過程中乳酸菌活菌數變化分析

酸奶中乳酸菌活菌數是評價產品對人體營養與健康作用的重要指標，GB 4789.35—2016中規定產品中的乳酸菌數不得低于1×106CFU/mL。酸奶發酵過程中，乳酸菌的生長繁殖及產生的代謝產物會引起酸奶產品發生一系列變化，乳酸菌活菌數對酸奶的發酵風味、貨架期長短有直接影響。酸奶發酵、冷藏過程中的乳酸菌活菌數變化如圖3所示。

圖3 酸奶發酵、冷藏過程中乳酸菌活菌數變化Fig.3 Changes in the number of lactic acid bacteria of yogurt during the fermentation and refrigeration

由圖3可知，酸奶在發酵6～8 h是乳酸菌生長的對數期，乳酸菌數量急劇增加，發酵8～10 h時緩慢增加；在發酵至冷藏過度階段乳酸菌數量迅速降低，這是因為該階段低溫低酸的環境已經不再適合乳酸菌微弱的生長，乳酸菌數迅速減少[22]。在冷藏后

期，乳酸菌數目逐漸上升，在第5天即冷藏120 h時達到最大值為7.15×109CFU/mL，之后緩慢下降，可能原因是此時pH值較低，引起細胞膜電荷變化，改變其通透性，從而影響乳酸菌對營養物質的吸收以及胞內酶的活性，因而乳酸菌的生長受到抑制，甚至死亡。

2.3 酸奶發酵、冷藏過程中氨基酸含量變化分析

乳酸菌在發酵過程中能降解蛋白質為小肽，然后轉化成各種氨基酸供其利用，且氨基酸能影響發酵乳質構特性、營養、風味等[23]，如添加半胱氨酸能增加發酵乳稠度；同時乳酸菌進行氨基酸代謝可產生風味物質，從而影響發酵乳風味[24]。本試驗采用HPLC對酸奶中的氨基酸含量進行檢測，樣品氨基酸HPLC色譜圖如圖4所示，酸奶發酵、冷藏過程中的氨基酸種類及含量變化如表2所示。

圖4 酸奶發酵、冷藏過程中氨基酸分析色譜圖Fig.4 Amino acid analysis chromatogram of yogurt during the fermentation and refrigeration

表2 酸奶發酵、冷藏過程中氨基酸含量變化 單位：mg/g

注：“E”表示必需氨基酸，“F”表示鮮味氨基酸。同一行上標小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由表2可知，酸奶總氨基酸含量和必需氨基酸含量在發酵6～10 h持續上升，變化顯著(P<0.05)，原因是此階段pH值在5.2～5.8，保加利亞乳桿菌有效分解蛋白產生大量氨基酸，發酵到10 h含量最高分別為1 311和546 mg/g。冷藏后熟過程中總氨基酸數量先降后升，原因是蛋白質水解成氨基酸的過程和乳酸菌利用氨基酸的過程同時存在，乳酸菌受到低溫的影響，蛋白質代謝活性受到極大抑制，氨基酸產量下降，此后蛋白質的水解作用占主導，氨基酸含量開始增加，該變化與MENG等[25]的研究結果一致。

發酵、冷藏過程中必需氨基酸中亮氨酸的含量顯著高于其他氨基酸，在發酵過程中最高含量為168 mg/g、冷藏過程中最高含量為107 mg/g；其次是賴氨酸，賴氨酸是親水氨基酸中的堿性氨基酸；蛋氨酸和其他氨基酸相比，含量較少，蛋氨酸為含硫氨基酸，其在發酵及冷藏過程中被降解成含硫的香氣化合物。鮮味氨基酸在發酵6～10 h持續上升，發酵10 h含量達到最大值為811 mg/g，變化顯著(P<0.05)，在冷藏前期趨于平緩，冷藏96 h時達到最大值后又開始下降，鮮味

氨基酸中谷氨酸的含量最高為163 mg/g。

2.4 酸奶發酵、冷藏過程中脂肪酸含量變化分析

酸奶的香氣和風味主要來源于非揮發性酸、揮發性酸和羰基化合物，其中揮發性成分的濃度決定了最終風味的組成，以C2～C10脂肪酸為主的揮發性脂肪酸會產生酸奶氣味中的主要酸味感[26]。本試驗采用GC對酸奶進行脂肪酸含量檢測，樣品脂肪酸GC色譜圖如圖5所示，酸奶在發酵、冷藏過程中的脂肪酸種類及含量變化如表3所示。

圖5 酸奶發酵、冷藏過程中脂肪酸分析色譜圖Fig.5 Fatty acid sample chromatogram of yogurt during the fermentation and refrigeration

表3 酸奶發酵、冷藏過程中脂肪酸相對含量變化 單位：%

注：“SFA”表示飽和脂肪酸；“MUFA”表示單不飽和脂肪酸；“PUFA”表示多不飽和脂肪酸；“SCFA”表示短鏈脂肪酸；“MCFA”表示中鏈脂肪酸；“LCFA”表示長鏈脂肪酸。

由表3可知，脂肪酸含量在發酵、冷藏期間持續上升，但都沒有達到顯著的水平(P>0.05)，發酵到10 h時長鏈脂肪酸含量最高，占總脂肪酸含量的69.839%，在冷藏階段長鏈脂肪酸含量最高值占總脂肪酸含量的70.124%，其原因是在整個過程中氨基轉移酶代謝為酮酸類物質，最終轉化為醛、醇及脂肪酸類物質[27]；飽和脂肪酸相對含量最高的為十六烷酸，其次是十四烷酸；在單不飽和脂肪酸中相對含量最高的是油酸23.629%，多不飽和脂肪酸中相對含量最高的是十八碳二烯酸為8.177%。單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸在整個發酵、冷藏過程逐漸降低，但都沒有達到顯著的水平(P>0.05)，原因是單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸發生氧化反應，繼而分解為氣味閾值較低的羰基化合物[28]。酸奶中的短鏈脂肪酸含量在9%～11%，其比長鏈脂肪酸更易消化吸收，并且具有保健功效，在發酵、冷藏階段短鏈脂肪酸逐漸增加，可能是乳酸菌的脂肪酶對短鏈脂肪酸表現出底物特異性，進一步促進短鏈脂肪酸的生成[29]。酸奶中長鏈脂肪酸的含量較高，在69%左右，發酵后長鏈脂肪酸從69.066%增加至70.124%，這與孟和畢力格等[30]的研究結果一致，可能是因為發酵促進了乳中的中、長鏈脂肪酸發生氧化降解生成揮發性脂肪酸和大量乙酰輔酶A，乙酰輔酶A進一步羧化生成丙二酸單酰輔酶A，在脂肪酸合成酶作用下經縮合、還原、脫水、還原一系列反應重新合成長鏈脂肪酸，這是發酵劑中脂肪酸降解酶、合成酶綜合作用的結果。

3 結論

本試驗測定了酸奶在發酵、冷藏過程中的pH值、酸度、持水力、黏度等理化指標，乳酸菌活菌數和氨基酸、脂肪酸等風味成分含量。酸奶持水力、黏度、酸度、pH值等理化指標在發酵階段出現顯著變化，冷藏階段變化緩慢；酸奶乳酸菌活菌數在發酵、冷藏階段表現為逐漸增加—迅速降低—緩慢上升的趨勢；氨基酸總量、必需氨基酸和非必需氨基酸含量在發酵、冷藏階段表現為逐漸上升—迅速降低—緩慢上升的趨勢；脂肪酸含量在發酵、冷藏期間持續上升，其中多不飽和脂肪酸在整個發酵、冷藏階段逐漸降低，而短鏈脂肪酸、中鏈脂肪酸及長鏈脂肪酸逐漸增加。充分探討了酸奶發酵及冷藏過程中理化指標、乳酸菌活菌數及主要風味成分變化情況，旨在為酸奶及發酵乳產品的研發、生產、品質評價分析提供理論數據參考。