海參腸道產蛋白酶菌的分離鑒定及其在海參下腳料中的應用

李震，肖秧，甄天元，樸美子

(青島農業大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266109)

蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的一類酶的總稱，它在消化吸收[1-2]、抗氧化[3-4]、降低過敏反應[5]、洗滌劑添加劑[6]、生物活性肽[7-9]等方面發揮著重要作用。目前，蛋白酶的種類主要分為動物蛋白酶[10-11]、植物蛋白酶[12]和微生物蛋白酶[13]。微生物菌群復雜多樣，分布較廣，繁殖速度較快，具有參與體內新陳代謝，調節內分泌，免疫調節等多種作用[14-15]。海洋微生物酶是一種獲得新型酶制劑方式[16]，在工業過程和產品制作得到廣泛應用[17-18]。王鳳舞等[19]對來自裙帶菜的1株產低溫堿性蛋白酶內生菌株QD-1，經鑒定該菌株為芽孢桿菌屬，該菌產生的蛋白酶的最適作用溫度為20 ℃，最適作用pH 9.0，Mn2+對該酶有較強的激活作用，Zn2+，金屬蛋白酶抑制劑(ethylenediaminetetra aceticacid，EDTA)和絲氨酸蛋白酶抑制劑(phenylethanesulfonyl fluoried,PMSF)對該酶有抑制作。李倩倩等[20]以單環刺螠內臟為原料，分離出1種單環刺螠內臟蛋白酶LPN2，分子質量約59 ku，其最適溫度為50 ℃，最適pH 6～8，PMSF、EDTA、Ca2+、Zn2+和Ba2+抑制蛋白酶LNP2的酶活，Fe2+在低濃度下對該酶有激活作用。BANERJEE等[21]從魚腸中分離的細菌菌株棒狀桿菌ATH3產生的胞外蛋白酶和淀粉酶，純化的蛋白酶和淀粉酶的分子質量分別為17和28 kDa，酶的最適pH 7.5～8.0，最適溫度35～45 ℃。目前，人們已經從海參體壁[22]、腸[23]和消化道[24]提取出蛋白酶粗酶，而對從海參腸中分離出蛋白酶菌株的研究較少。

本研究擬從海參腸道中分離篩選出1株產蛋白酶活性較高的菌株，對該菌株進行鑒定，以酶活力為指標，對其產酶發酵條件進行優化；利用該菌發酵海參腸產多肽，優化了發酵工藝條件，并對海參腸發酵產物多肽的抗氧化活性進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活刺參(Apostichopusjaponicas)：由青島佳日隆海洋食品有限公司提供；海參腸(經水煮，去雜質，脫鹽，初步脫脂后瀝干而成)：由青島佳日隆海洋食品有限公司提供，于-20 ℃保存；干紅棗：福建古田縣大豐工貿有限公司；蘋果醋：鶴山市東古調味食品有限公司售；蜂蜜：山東華康蜂業有限公司售。

固體培養基：LB營養瓊脂3.3 g，海水100 mL，121 ℃滅菌15 min。酪蛋白培養基：干酪素1 g，酵母膏0.1 g，瓊脂1.5 g，海水100 mL，pH 7.2-7.4，121 ℃滅菌15 min。液體培養基：蛋白胨0.5 g，酵母膏0.1 g，磷酸高鐵0.01 g，海水100 mL，pH 7.8～8.0，121 ℃滅菌15 min。

酪蛋白(casein)：上海索萊寶生物科技有限公司；偶氮酪蛋白(azocasein)：美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)：美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DU-800型紫外分光光度計，美國貝克曼公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DHP-9032電熱恒溫培養箱，中國龍口市先科儀器有限公司；IS-RDV3立式恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離與鑒定

(1)菌株的分離純化

取活體刺身內臟，剪碎，按100 g/L加入無菌海水制成菌液原液，梯度稀釋后分別涂布于固體培養基， 25 ℃，靜置培養3 d。挑取單菌落點接種于酪蛋白培養基，25 ℃，培養24 h，觀察透明圈大小。選取菌落周圍有透明圈的菌株進行分離純化。挑取適量的菌株，接種于液體培養基上，25 ℃，180 r/min，3 d，選擇產蛋白酶活性較高的菌株為目的菌株。挑取少量菌株接種于固體培養基上，置于25 ℃靜置培養3 d，觀察目標菌株的菌落形態，并進行革蘭氏染色，觀察菌株的個體形態，芽孢等。

(2)蛋白酶活性的測定

蛋白酶活性的測定采用參照RANILSON的偶氮酪蛋白法[25]。

(3)形態學及生理生化鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》進行形態學及生理生化鑒定。

(4)16S rDNA序列分析

采用CTAB[26]法提取基因組DNA，PCR產物的純化和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。序列提交GeneBank數據庫，用Blast軟件在GeneBank網站上進行相似性搜索，獲取相近典型菌株的16S rDNA基因序列，通過Clustal進行多重序列比對，利用MEGA 5.0軟件繪制出系統發育樹。

1.3.2 QDHF-1菌株產酶發酵條件工藝優化

參照朱玫瑛[27]的前期單因素試驗研究結果，采用L9(33)正交試驗，以pH值、溫度、發酵時間3個因素為影響因素，以蛋白酶活力為指標，對產酶發酵工藝進行正交優化，因素水平見表1。

1.3.3 QDHF-1菌株發酵海參腸工藝優化及抗氧化活性測定

(1)BSA標準曲線的繪制

將BSA標準品(5 g/L)用生理鹽水配置成質量濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的溶液，置于離心管中。將BCA試劑盒中的A試劑和B試劑按照50∶1的體積比充分混勻，得到BCA工作液。用移液槍從各濃度的BSA管中吸取20 μL溶液，并與200 μL的BCA工作液充分混勻，置于37 ℃水浴中振搖1 h，用蒸餾水做空白。在562 nm下測定吸光值，繪制BSA標準曲線。

表1 L9(33)正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels in L9(33) orthogonalexperiment design

(2)多肽含量的測定

采用BCA法[28]測定樣品中的多肽含量。向試管中加入已稀釋好的相應倍數的樣品溶液20 μL，同時加入已經配好的BCA溶液200 μL，迅速混勻，于水浴37 ℃放置60 min。波長562 nm下測定吸光度值，試驗重復3次，根據標準曲線計算樣品中多肽的百分含量。

(3)QDHF-1種子液的制備

將Thalassobacillussp. QDHF-1菌株接種到液體培養基上，30 ℃，180 r/min，培養24 h，制備液體種子液培養基。

(4)接種量對QDHF-1發酵海參腸發酵液中多肽含量的影響

取洗凈瀝干的海參腸用組織搗碎機搗碎，稱取5 g，料水比為1∶10，接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%，發酵時間為60 h，溫度30 ℃，轉速180 r/min，培養結束后離心，分別測定上清液的多肽含量。

(5)發酵時間對QDHF-1發酵海參腸發酵液中多肽含量的影響

取洗凈瀝干的海參腸用組織搗碎機搗碎，稱取5 g，料水比(g ∶mL)為1∶10，接種量為6%，發酵時間分別為12、24、36、48、60 h，溫度30 ℃，轉速為180 r/min，培養結束后離心，分別測定上清液的多肽含量。

(6)料水比對QDHF-1發酵海參腸發酵液中多肽含量的影響

取洗凈瀝干的海參腸用組織搗碎機搗碎，稱取5 g，料水比(g∶mL)分別為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，接種量為6%，發酵時間為36 h，溫度30 ℃，轉速180 r/min，培養結束后離心，分別測定上清液的多肽含量。

1.3.4 海參腸發酵物抗氧化活性測定

利用QDHF-1菌株發酵海參腸的的最佳工藝條件為接種量6%，料水比1:5，發酵時間36 h，可得到多肽質量濃度達13.21 g/L。海參腸發酵液經離心去除菌體及雜質，再經濃縮、冷凍干燥，獲得海參腸發酵物多肽，并對其進行抗氧化測定。

(1)羥自由基(·OH)清除能力的測定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[29]。

(2)二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的測定采用ALI等的測定方法[30]。

(3)超氧陰離子自由基(O2-·)清除能力的測定采用鄰苯三酚自氧化法[31]。

1.3.5 統計分析方法

試驗數據以平均值±標準差(M±S.D.)表示，采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。分析方法為單因素方差分析和鄧肯(Duncan)多重比較，顯著性水平選擇0.05。

2 結果與分析

2.1 產蛋白酶菌株的篩選

海參腸道產蛋白酶菌株的初篩結果如圖1和表2所示。經分離得到的5株菌株，菌落直徑差異不顯著(P>0.05)，但QDHF-1菌株所產的透明圈直徑與菌落直徑比值顯著高于其他菌株(P<0.05)。酪蛋白培養基上水解透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d值)越大說明產酶能力越強，所以QDHF-1菌株具有較高產蛋白酶的能力。不同菌株發酵液產蛋白酶活力的測定結果如圖2所示。其中QDHF-1菌株產的蛋白酶活性較高，產蛋白酶活力為582 U/mL，顯著高于其他菌株(P<0.05)。綜合水解透明圈和酶活力兩個因素，選擇QDHF-1菌株為出發菌株。

圖1 QDHF-1菌株透明圈實驗結果Fig.1 Results of transparent circle test of QDHF-1 strain

表2 海參腸道產蛋白酶菌株初篩結果Table 2 Screening results of protease-producingstrains from tract of sea cucumber

菌落編號透明圈直徑(D)/mm菌落直徑(d)/mmD/d值QDHF-120.30±0.57d6.66±0.29ab3.2±0.17bQDHF-213.16±0.31c6.83±0.23ab1.91±0.20aQDHF-312.96±0.45c7.25±0.53ab1.78±0.24aQDHF-412.05±0.33b7.33±0.65b1.64±0.11aQDHF-510.12±0.20a6.42±0.35a1.57±0.34a

注：同一列不同字母上標代表數值間差異顯著(P<0.05)。下同。

圖2 不同菌株發酵液產蛋白酶活力的測定Fig.2 Determination of protease activity in fermentation broth of different strains注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 QDHF-1菌株產酶發酵條件工藝優化

如表3所示，3個單因素中，對QDHF-1產酶發酵的影響順序為時間>pH值>溫度，因此最佳產酶發酵條件為pH 8，溫度為30 ℃，發酵時間72 h。

表3 正交試驗結果表Table 3 Results of the orthogonal experiment

2.3 QDHF-1菌株的鑒定結果

2.3.1 形態特征及生理生化鑒定

QDHF-1的菌落形態是乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊、濕潤的光滑小菌落。對QDHF-1菌株進行革蘭氏染色和芽孢染色，結果如圖3所示，QDHF-1為革蘭氏陽性、產芽孢的兩端鈍圓的桿狀細菌。對QDHF-1菌株進行部分生理生化鑒定試驗，結果如表4所示。查閱《伯杰細菌鑒定手冊》和《細菌系統鑒定手冊》，并未發現有對應生理特征的種屬分類。因此，對QDHF-1菌株采用16S rRNA基因序列分析進行鑒定。

圖3 菌株QDHF-1的革蘭氏染色觀察Fig.3 The image of QDHF-1 after gram stain

表4 生理生化鑒定Table 4 Physiological and biochemical experiments

試驗名稱試驗結果試驗名稱試驗結果酪素水解試驗+硝酸鹽還原試驗+吲哚試驗-葡萄糖利用試驗+甲基紅試驗+果糖利用試驗+V.P. 試驗-甘露醇利用試驗+硫化氫試驗+5%(質量分數)NaCl+明膠液化試驗-7%(質量分數)NaCl+淀粉水解試驗+10%(質量分數)NaCl+接觸酶試驗-

注：表中“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應。

2.3.2 16S rDNA全序列分析

2.3.2.1 PCR擴增結果

經PCR擴增獲得菌株16S rRNA基因片段的長度為1 500 bp左右，如圖4所示，條帶清晰，可用于菌株16S rRNA序列的測定。

圖4 16S rRNA基因PCR擴增產物Fig.4 PCR amplification product of 16S rRNA gene

2.3.2.2 系統發育樹分析

登陸www.NCBI.com網站，在GeneBank中通過Blast得到與QDHF-1菌株序列相似度較大的菌株，通過Clustul軟件同GeneBank中的相似序列進行比對，可知QDHF-1與Thalassobacillussp. LY18同源性為99.3%。利用MEGA 5.0軟件繪制出系統發育樹，可以確定QDHF-1為Thalassobacillus屬。將QDHF-1序列提交GeneBank獲得登錄號為KF357910(圖5)。QDHF-1菌株屬于Bacteria(細菌)，Firmicutes(厚壁菌門)，Bacilli(桿菌)，Bacillales(芽孢桿菌目)，Bacillaceae(芽孢桿菌科)，Thalassobacillus屬，命名為Thalassobacillussp.QDHF-1。

圖5 QDHF-1菌株16S rRNA同源性構建的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain QDHF-1 on 16S rRNA gene sequence

2.4 QDHF-1菌株對海參腸發酵產多肽的工藝優化

2.4.1 接種量對發酵產多肽含量的影響

接種量對QDHF-1發酵海參腸發酵液中多肽含量的影響結果如圖6所示。隨著接種量不斷增加，發酵液中多肽含量呈先上升后下降的趨勢。當接種量在2%～8%時，發酵液中多肽含量呈上升趨勢，當接種量為6%和8%時，發酵液的多肽含量沒有顯著性差異(P<0.05)。因此選擇接種量為6%較為合適，此時發酵液中多肽質量濃度為5.02 g/L。當接種量為10%時，多肽含量開始下降，可能是由于菌體數量過多，開始分解發酵液中的多肽所致。

圖6 接種量對發酵液產多肽含量的影響Fig.6 Effect of inoculum size on the content of polypeptide in fermentation

2.4.2 發酵時間對發酵產多肽含量的影響

發酵時間對QDHF-1發酵海參腸發酵液中多肽含量的影響結果如圖7所示。隨著發酵時間的增加，發酵液中多肽含量呈先上升后下降的趨勢。當發酵時間為36 h，多肽含量達到最大值為7.66 g/L，顯著高于其他組(P<0.05)。隨著發酵時間的延長，發酵液中多肽含量開始逐漸下降，可能是菌體開始消耗多肽所致。因此選擇發酵時間為36 h較為合適。

圖7 發酵時間對發酵液產多肽含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on polypeptide content in fermentation

2.4.3 料水比對發酵產多肽含量的影響

料水比對QDHF-1發酵海參腸發酵液中多肽含量的影響結果如圖8所示。隨著料水比的不斷增加，肽含量呈先增加后下降的趨勢。當料水比為1∶5(g∶mL)時，多肽質量濃度為13.21 g/L，顯著高于其他組(P<0.05)。隨著料水比的繼續增加，肽含量不斷減小，原因可能是料水比的增加造成了肽含量的稀釋。因此選擇料水比為1∶5(g∶mL)較為合適。

圖8 料水比對發酵液產多肽含量的影響Fig.8 Effect of solid-liquid ratio on polypeptide content in fermentation

2.5 海參腸發酵物多肽的抗氧化活性

2.5.1 不同濃度海參腸發酵物多肽對羥自由基(·OH)的清除能力

不同濃度的海參腸發酵物多肽對羥自由基的清除作用結果，如圖9所示。隨著海參腸發酵物多肽質量濃度的增大，對羥自由基的清除率逐漸增大，質量濃度為50 g/L時，清除率為93.94%。因此，海參腸發酵物多肽對羥自由基具有良好的清除能力。

圖9 海參腸發酵物多肽對·OH的清除作用Fig.9 ·OH scavenging effects of fermentation product polypeptide of sea cucumber

2.5.2 不同濃度海參腸發酵物多肽對二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)的清除能力

不同濃度的海參腸發酵物多肽對DPPH·的清除作用結果，如圖10所示。隨海參腸發酵物多肽質量濃度的增大，DPPH·自由基清除率呈不斷增大的趨勢。當海參腸發酵物多肽質量濃度為50 g/L時，清除率為32.38%。隨著濃度繼續增加，對DPPH·自由基清除率維持在一定水平。

圖10 海參腸發酵物多肽對DPPH·的清除作用Fig.10 DPPH· scavenging effects of fermentation product polypeptide of sea cucumber

圖11 海參腸發酵物多肽對的清除作用 scavenging effects of fermentationproduct polypeptide of sea cucumber

3 結論

本實驗通過初篩和復篩從海參腸道中分離篩選獲得1株產蛋白酶的菌株QDHF-1，確定菌株QDHF-1是芽孢桿菌目，命名為Thalassobacillussp.QDHF-1，其最佳產酶發酵條件為pH 8，溫度30 ℃，發酵時間72 h。將菌株Thalassobacillussp.QDHF-1應用于發酵海參腸，其最佳工藝條件為接種量6%，料水比1∶5(g∶mL)，發酵時間36 h；海參腸發酵物多肽具有良好的抗氧化活性，其中對羥自由基的具有較強的清除能力，當海參多肽質量濃度為50 g/L時，對羥自由基清除率可達93.94%。本研究為開發具有抗氧化活性的海參腸解多肽產品提供實驗依據。