蠶蛹蛋白制備應(yīng)用與功能特性的研究進展

季曉嬌，閆文杰，張婧婕，韓迪，任廣旭，王靖*

1(北京聯(lián)合大學 生物化學工程學院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京，100023) 2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所，北京，100081)

我國是世界桑蠶業(yè)的發(fā)源地，至今已達5 000千年之久[1]，占據(jù)并保持“養(yǎng)蠶大國”的地位。蠶蛹為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的蛹，其資源豐富，產(chǎn)量巨大。我國年產(chǎn)家蠶蛹約30萬t，約占全世界總產(chǎn)量的80%[2];年產(chǎn)柞蠶蛹4萬t以上，占世界總產(chǎn)量的 90%以上[3]；蠶繭年產(chǎn)量65萬t，占世界總繭量的70% 以上[4]。蠶蛹營養(yǎng)價值豐富，并且具有較高的藥用價值。《本草綱目》記載蠶蛹“為末飲服，治小兒疳瘦，長肌，退熱，除蛔蟲；煎汁飲，止消渴”，現(xiàn)代醫(yī)學證明，蠶蛹具有保護肝臟、延緩衰老、增強免疫力、降血糖、保護視力、提高智力等藥理作用[5-7]。

蠶蛹中富含蛋白質(zhì)，占干蛹質(zhì)量的45%～50%[8-9]，且為優(yōu)質(zhì)蛋白。研究表明，蠶蛹蛋白具有增強免疫力、抗氧化、抗菌、抗疲勞等生物活性，因此，其在食品領(lǐng)域具有廣闊的市場發(fā)展前景。本文就蠶蛹的營養(yǎng)指數(shù)、提取精制、功能特性及應(yīng)用進展進行綜述，希望為蠶蛹蛋白的綜合利用和后續(xù)開發(fā)提供參考。

1 蠶蛹蛋白營養(yǎng)指數(shù)

蠶蛹蛋白是一種完全蛋白，其含有配比均衡的18種氨基酸，且8種為必需氨基酸。必需氨基酸與非必需氨基酸之比為0.73，高于WHO/ FAO提出的食品中必需氨基酸與非必需氨基酸之比為0.6的氨基酸組合模式[10-11]。蠶蛹蛋白的18種氨基酸及其含量見表1；蠶蛹蛋白中必需氨基酸含量與WHO/FAO評分模式比較見表2。

高樓村的變化，僅是該鎮(zhèn)開展“四美鄉(xiāng)村”“五美庭院”“美麗小鎮(zhèn)”建設(shè)的一個縮影。按照“試點先行、示范帶動、全面鋪開”的思路，該鎮(zhèn)優(yōu)先打造了高樓、水寨、張樓、新莊4個示范村，通過典型引路，連點成線、連線成片、集片成群，形成美麗鄉(xiāng)村建設(shè)的 “雁陣效應(yīng)”和改善農(nóng)村人居環(huán)境工作的“特色品牌”。

表1 蠶蛹蛋白的氨基酸含量[12] 單位：mg/g

注：▲為人體必需氨基酸。

表2 蠶蛹蛋白中必需氨基酸含量與WHO/FAO評分模式比較[6]Table 2 Comparison of essential amino acid content insilkworm pupa protein with WHO/FAO scoring model

注： AAS-氨基酸評分，為每克蛋白質(zhì)中必需氨基酸與氨基酸參考值的比值。

由表1可知，必需氨基酸如賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸等在蠶蛹蛋白中的含量相對較高；由表2可知，蠶蛹蛋白中的蘇氨酸以及含硫氨基酸的含量比評分模式稍低，而苯丙氨酸+酪氨酸以及異亮氨酸高于評分模式。除此之外，其他必須氨基酸的含量接近評分模式。

2 蠶蛹蛋白提取

蠶蛹蛋白不僅是蠶蛹的活性成分，并且集中表現(xiàn)了蠶蛹的營養(yǎng)價值和生理功能。目前，蠶蛹蛋白的提取方法主要有酶水解法、堿水解法、酸水解法、發(fā)酵法等。酸水解法可徹底快速地水解蛋白質(zhì)，且不會引起消旋作用，但后續(xù)的酸液會對環(huán)境產(chǎn)生污染，水解產(chǎn)物有異味。堿水解法耗時短、損失小、能耗低，但會使L型氨基酸變成D型，且兩種水解方法都不存在專一性。酶法水解過程溫和、安全，且價格低廉，原料易取。與其他方法相比，酶水解法條件溫和，蠶蛹蛋白的營養(yǎng)價值受損較小，水解過程易于控制，還能對蠶蛹蛋白質(zhì)進行定位水解而產(chǎn)生特定生理活性肽，并且雙酶水解法效果更好，產(chǎn)率更高。具體提取方法的工藝參數(shù)及產(chǎn)率見表3。

表3 蠶蛹蛋白不同提取方法的分析比較Table 3 Analysis and comparison of different extraction methods of silkworm pupa protein

由于蠶蛹油脂含量較高，增加了其蛋白的分離制備難度，并且蠶蛹本身色素以及腥味物質(zhì)等也限制了其進一步開發(fā)與利用，因此制備蠶蛹蛋白的過程必須

3 蠶蛹蛋白精制

另外，呂興梅等[18]發(fā)明了一種蠶蛹蛋白的制備方法，創(chuàng)新采用離子液體對蠶蛹蛋白進行提取分離，且進行二次提取，將一次得到的蠶蛹蛋白和離子液體混合液通過再生沉淀劑洗脫離子液體得到再生蠶蛹蛋白。與表3中現(xiàn)有技術(shù)相比，此法操作簡單無污染，避免了傳統(tǒng)堿溶酸沉淀法對設(shè)備的腐蝕，蛋白純化度高，且原料廉價易得，實現(xiàn)了蠶蛹蛋白的高效簡便生產(chǎn)。

要進行脫脂、脫色、除臭等精制處理。

3.1 脫脂

對于蛋白質(zhì)下游產(chǎn)品的品質(zhì)來說，外觀色澤較為重要。因此，在蠶蛹蛋白精制過程中，脫色尤為必要。對于蠶蛹蛋白的呈色，一般認為有3種原因，(1)食用桑葉所導致的葉綠素殘留，較易去除；(2)蠶蛹體內(nèi)的花青素在光和熱的條件下發(fā)生縮聚反應(yīng)所致；(3)蛋白質(zhì)在提取加工等過程中發(fā)生的Strecker反應(yīng)及Maillard反應(yīng)[26]。目前，蠶蛹蛋白的脫色方法主要有氧化劑氧化漂白、活性炭吸附法和蛋白質(zhì)修飾法。具體脫色工藝見表5。

表4 不同溶劑的蠶蛹脫脂工藝分析比較Table 4 Comparison and analysis of silkworm degrease process with different solvents

根據(jù)表4可知，單組分溶劑和混合溶劑都能達到較為滿意的脫脂效果，后續(xù)溶劑的毒性及殘留問題應(yīng)著重考慮。另外，錢俊青[19]證明了在采用極性溶劑的情況下，含水量越低脫脂效果越好，而在非極性溶劑的情況下，此結(jié)論不能類推，需要一個較為精確合適的含水量。

隨著研究的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了較傳統(tǒng)壓榨法和溶劑浸出法更優(yōu)越的方法。超臨界CO2法對油脂類物質(zhì)具有較好的溶解能力，并且工藝簡單、操作方便、無溶劑殘留、對熱敏性和易揮發(fā)性物質(zhì)具有良好保護作用。分子蒸餾技術(shù)存在蒸餾溫度和壓力低、物料受熱時間短、分離程度及產(chǎn)品收率高和分離速度快等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于蠶蛹的脫脂工藝。

3.2 脫色

目前，常見的脫脂方法有溶劑浸出法、機械壓榨脫脂法和機械離心脫脂法3種。蠶蛹中粗纖維含量很低，導致蠶蛹質(zhì)地較軟，不易壓榨，而且機械壓榨脫脂法易致蛹殼破碎,產(chǎn)生雜質(zhì)；機械離心脫脂法的殘油率高至8%～12%,資源浪費嚴重；溶劑浸出法殘留油脂則在5%以下,故溶劑浸出法成為最廣泛的脫脂方法。對于溶劑浸出法來說，選擇合適的浸出溶劑是關(guān)鍵，浸出溶劑必須對蠶蛹中的脂肪有合適并且良好的溶解性，卻不能溶解蠶蛹蛋白，并且有適中的沸點，可利用蒸餾去除溶劑。不同溶劑進行的脫脂工藝見表4。

表5 蠶蛹蛋白不同的脫色工藝分析比較Table 5 Analysis and comparison of different decolorization processes of silkworm pupa protein

從表5可以看出，有機溶劑法脫色效果較好，且操作簡單，但對于潛存的Strecker反應(yīng)及Maillard反應(yīng)引起的褐色現(xiàn)象卻難以避免；采用活性炭方法簡便，易于控制，但目標產(chǎn)物損失較嚴重；采用H2O2氧化法可進行脫色，但影響產(chǎn)物的活性；蛋白質(zhì)修飾法可以將有色物質(zhì)進行脫色，效果顯著，為后續(xù)蠶蛹蛋白的商品化提供了技術(shù)支持。

由2名臨床醫(yī)師根據(jù)評價標準獨立進行文獻檢索并篩選，在提取資料遇到分歧時，則通過討論或第三方意見決定。提取每篇文獻的數(shù)據(jù)內(nèi)容包括：第一作者姓名、發(fā)表年份、實驗類型、患者人數(shù)、病例數(shù)目、年齡、性別、Paprosky分型、平均隨訪時間和并發(fā)癥種類及數(shù)量。分析指標包括：多孔鉭金屬加強塊重建Paprosky II、III型髖臼骨缺損并發(fā)癥的總數(shù)及發(fā)生率，術(shù)區(qū)感染、假體無菌性松動、髖關(guān)節(jié)脫位和血管神經(jīng)損傷等其他并發(fā)癥。

3.3 脫臭

蠶本身腺體的分泌物以及在貯藏加工過程中產(chǎn)生的水溶性、能會發(fā)的酸性成分類和胺類等堿性成分以及溶于有機溶劑中的酸、酚、醇、高級烷烴等物質(zhì)，使蠶蛹具有特殊的臭味。除臭方法主要有有機溶劑浸提法、吸附劑法、蒸餾法、微生物法、氧化法和綜合除臭法等。具體脫臭工藝見表6。

這晚，青瓷和李光北請王金貴在鎮(zhèn)上最好的飯店吃飯，李光北上洗手間時，王金貴一把就抓住了青瓷的手，兩人久久凝望，卻什么都沒有說。

表6 蠶蛹蛋白的不同除臭方法分析比較Table 6 Analysis and comparison of different deodorization methods of silkworm pupa protein

從表6可知，綜合法脫臭效果好，但成本高、工藝復雜；微生物法效果明顯，但培養(yǎng)條件較嚴格，須規(guī)范操作；蒸餾法、有機溶劑浸提法、氧化法、吸附法操作簡單，樣品用量少，應(yīng)用廣闊。

3.增強溝通機制，搭建互動平臺。多年的實踐證明，油田與地方政府及農(nóng)戶的關(guān)系具有接觸時間長、工作頭緒多的特點。因此，油田應(yīng)與地方政府建立多層次的溝通機制，堅持高層會晤、油地部門聯(lián)席會議以及基層工作座談會等制度。油地雙方建立健全聯(lián)防聯(lián)治機制，對重點油氣井、油氣聯(lián)合站、油氣罐區(qū)、油庫等重要基礎(chǔ)設(shè)施，實行承包責任制；大力開展工農(nóng)共建、文明油區(qū)創(chuàng)建活動，密切油地關(guān)系，創(chuàng)建模范油區(qū)；在重要設(shè)施建設(shè)、整體規(guī)劃部署上公開公平地進行協(xié)商，本著互惠互利的原則，制定相應(yīng)的發(fā)展策略，從而達到增進相互了解和信任，實現(xiàn)企地關(guān)系的良性互動。

第二種類型的釘子戶發(fā)生在S社區(qū)。2016年3月，S社區(qū)的整體搬遷工程正式啟動，計劃2016年11月前完成。這是一個普通的工人家庭，抗爭了一年多，2017年5月份才同意簽約。為什么不愿意搬遷？根據(jù)訪談反饋，這個釘子戶發(fā)現(xiàn)之前在J社區(qū)的拆遷工程中，僵持到最后的居民大都可以或多或少以較高的價格簽約，因此，他認為最后簽約可獲得高額的補償款，因此一直僵持。這是一種典型的耍無賴、人心貪的釘子戶，也是拆遷過程中最常見的釘子戶。

3.4 其他工藝

溫紅珊等[35]利用爬桿實驗和負重游泳實驗觀察了昆明小鼠的抗疲勞能力，發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白明顯延長了其爬桿時間和游泳時間，且生化指標結(jié)果表明，蠶蛹蛋白增加了小鼠體內(nèi)肌糖原和肝糖原的含量，降低了運動過程產(chǎn)生的血清尿素氮以及血乳酸的含量，證明蠶蛹蛋白具有良好的抗疲勞作用。張麗萍等[36]通過人體的抗疲勞試驗發(fā)現(xiàn)，食用蠶蛹蛋白可升高最大耗氧量值，明顯增加機體運動耐力，降低血乳酸，從而增加受試者的抗疲勞能力。周思敏等[37]研究表明，蠶蛹蛋白可降低血乳酸含量，延長小鼠力竭游泳時間并提高肝糖原含量。

塊莖入窖后，在窖溫降低時應(yīng)在薯堆頂部覆蓋一層干草或舊麻袋片等，使之吸濕，散發(fā)水分，固塊莖貯藏期間堆內(nèi)塊莖呼吸散發(fā)的水分常凝結(jié)在上層塊莖上，即所謂出汗。加覆蓋物吸濕散發(fā)水分，可防止上層塊莖霉爛。

趙鐘興等[38]研究發(fā)現(xiàn)，以體外血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的抑制率作為降低血壓的指標，通過堿性蛋白酶對蠶蛹蛋白進行酶解，其酶解產(chǎn)物對ACE的抑制率可達50.30%。證明蠶蛹蛋白具有降低血壓的功效。路福平等[39]通過對大鼠血清中ACE活性、一氧化氮合酶(NOS)活性、一氧化氮(NO)含量及內(nèi)皮素(endothelin，ET)含量的研究發(fā)現(xiàn)，蠶蛹蛋白可以抑制ACE、NOS的活性，降低NO和ET的含量，證明了其降血壓的作用。

4 蠶蛹蛋白功能特性

蠶蛹經(jīng)提取精制所得的蠶蛹蛋白已被研究證明具有抗腫瘤、抗氧化、降血壓和抗疲勞等諸多功效，并且其營養(yǎng)價值與功能特性也逐漸被人們熟知。

4.1 抗疲勞

去除蠶蛹表面甲殼對于精制蛋白也是必不可少的，對于下游產(chǎn)品的開發(fā)尤為重要。倪紅等[32]采用4%的NaOH,在100 ℃下反應(yīng)1 h，實現(xiàn)了蠶蛹蛋白與甲殼的分離。

4.2 降血壓

當?shù)鞍踪|(zhì)水解物的分子質(zhì)量<6 000 Da時，則會呈現(xiàn)苦味，其來源為苦味氨基酸和苦味肽。因此，為保證產(chǎn)品口感須除去味苦物質(zhì)。陳靜等[34]利用質(zhì)量分數(shù)為3%的活性炭，消除了酶解液產(chǎn)生的苦味，產(chǎn)生了較好的效果。

4.3 抗氧化

肖燕平等[40]研究發(fā)現(xiàn)，以苦基苯肼(DPPH)自由基清除率為指標，蠶蛹蛋白在pH 7.50、溫度30 ℃、3.50%堿性蛋白酶、酶解20 min的條件下，分子質(zhì)量≤5 ku蛋白組分抗氧化能力最強，DPPH自由基清除率可達79.90%。周菊香等[41]通過動物喂養(yǎng)實驗，對小鼠血清膽固醇、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活力等生理指標進行檢測，發(fā)現(xiàn)多肽+高膽固醇組與空白組相比，SOD酶活力顯著升高，且降低了MDA水平；與高膽固醇組相比，血清膽固醇水平存在明顯差異，證明了蠶蛹蛋白在抗氧化方面的作用。

4.4 抗腫瘤

胡德聰?shù)萚42]以人肝癌細胞株SMMC-7721為模型，用MTT比色法分析發(fā)現(xiàn)蠶蛹多肽溶液對癌細胞具有明顯抑制作用。閆琦濤等[43]通過對人肺腺癌株(A549)、腎癌株(Ketr-3)的研究發(fā)現(xiàn)，蠶蛹多肽溶液存在對肺癌細胞和腎癌細胞的周期特異性，可以損傷癌細胞DNA，降低癌細胞存活率，并且腫瘤細胞總蛋白的含量隨著蠶蛹多肽溶液濃度的增加而降低(P<0.01)，明顯延長了EAC(艾氏腹水癌細胞)小鼠的生存時間，此結(jié)果充分表明了蠶蛹多肽蛋白存在明顯的抗腫瘤作用。

4.5 抗菌

HARA等[44]從家蠶中分離出一種新型抗菌肽-moricin，通過化學合成moricin基因并插入到2個表達載體pXa1和pMAL-c2中，研究結(jié)果表明，人工重組moricin與天然moricin的結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量相同,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性相當。羅富英等[45]采用蠶蛹抗菌肽作為防腐液處理鮮豬肉，結(jié)果表明抗菌肽質(zhì)量分數(shù)在0.05%時，對乳酸菌、微球菌、葡萄球菌的抑菌效果分別為89.0%、94.3%、98.9%，并且經(jīng)蠶蛹抗菌肽進行防腐處理的鮮豬肉在室溫中可貯存7d，是比較理想、安全的抗菌物質(zhì)。

4.6 增強免疫力

劉雋彥等[46]通過對免疫力低下小鼠的試驗結(jié)果表明，蠶蛹多肽可顯著提高其外周血細胞數(shù)量和免疫器官質(zhì)量，促進B、T淋巴細胞的增殖。證明蠶蛹蛋白具有增強免疫力的功效。盧楠等[47]研究表明，柞蠶蛹蛋白多肽顯著調(diào)節(jié)了衰老小鼠的血液免疫細胞數(shù)和免疫器官指數(shù)，可提高小鼠的外周血白細胞數(shù)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，緩解小鼠免疫低下狀況，證明蠶蛹蛋白可增強免疫力、提高對外界的抵御能力。

5 蠶蛹蛋白在食品中應(yīng)用

蠶蛹中含有生物活性物質(zhì)，主要包括激素、抗菌肽及溶菌酶等，但蠶蛹中不含任何性激素[48],而這一特點正是保健食品所需。蠶蛹蛋白富含氨基酸，可作為營養(yǎng)物質(zhì)添加應(yīng)用于面包、餅干等植物性食品中，改善其營養(yǎng)結(jié)構(gòu)[49]。蠶蛹本身存在機體營養(yǎng)補充、促進生長發(fā)育和提高人體免疫力等功能[50-51]，是一種較為受歡迎的食品原料，并且蠶蛹是衛(wèi)生部批準的“作為普通食品管理的食品新資源名單”中唯一一個昆蟲類食品。

近年來，隨著對蠶蛹蛋白的深入研究，以蠶蛹蛋白活性成分作為食品原料的產(chǎn)品層出不窮。以蠶蛹蛋白氨基酸為原料的產(chǎn)品專利見表7，以蠶蛹水解氨基酸為原料的保健食品見表8。

11月1日-5日，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、湖南省人民政府共同主辦的第十六屆中國國際農(nóng)產(chǎn)品交易會暨第二十屆中國中部農(nóng)業(yè)博覽會在湖南長沙舉辦。同期由中國農(nóng)藥發(fā)展與應(yīng)用協(xié)會組織、主辦的第七屆綠色農(nóng)藥博覽會和2018農(nóng)藥行業(yè)品牌建設(shè)交流會也于11月2日順利召開。

表7 以蠶蛹氨基酸為原料的產(chǎn)品專利表Table 7 Patent table of products using silkworm pupa amino acid as raw material

表8 以蠶蛹氨基酸為原料的保健食品名稱Table 8 Patent table of products using silkworm pupa amino acid as raw material

6 結(jié)論

我國蠶蛹資源豐富，蠶蛹蛋白含量高，氨基酸種類豐富，且平衡性好，是一種極具經(jīng)濟價值和開發(fā)價值的自然資源。目前，國內(nèi)外已經(jīng)對蠶蛹蛋白進行了大量研究，但大部分都集中在實驗室階段，未形成大的產(chǎn)業(yè)化模式，工業(yè)化產(chǎn)品較少。作為一種優(yōu)質(zhì)的生物蛋白資源，蠶蛹蛋白具有抗腫瘤、抗氧化、提高機體免疫力等諸多功效，市場發(fā)展前景廣闊。因此，應(yīng)加快蠶蛹蛋白分離純化技術(shù)的研究，切實解決其生產(chǎn)加工問題，注重開發(fā)高附加值產(chǎn)品，以求獲得良好的經(jīng)濟效益和社會效益。