探針底物法評價柚皮苷對大鼠肝臟CYP3A1/2酶代謝活性的影響

程可羚，吳灝，白楊，樊威洋，蘇薇薇，李沛波

(中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

細胞色素P450(CYP450)酶是肝臟和腸中最為重要的Ⅰ相代謝酶，可催化大多數臨床藥物代謝；藥物對CYP450酶活性的誘導或抑制是引發藥物相互作用的常見機制[1]。目前，超過90%的治療藥物被認為主要是由CYP 3A4/5、2D6、2C9、2C19、2E1、1A2等亞型酶所代謝的[2-4]。其中，CYP3A4是非常重要的亞型酶之一，參與了約50%的上市藥物的代謝清除[5]。

柚皮苷為二氫黃酮苷類化合物，骨架結構由5,7,4′-三羥基-二氫黃酮苷元(柚皮素)與蕓香糖[2-O-(α-L-鼠李糖)-β-D-葡萄糖]構成。柚皮苷廣泛存在于蕓香科植物葡萄柚、桔、橙等水果植物及化橘紅、骨碎補、枳實、枳殼、橘紅、菝葜、枸櫞等中藥材中；日常食用的橙汁及葡萄柚汁也普遍含有柚皮苷[6-7]。目前，關于柚皮苷對CYP3A 酶代謝活性的影響，有關文獻報道說法不一。如，Bailey等[8]以12位健康男性為研究對象，研究柚皮苷對尼索地平口服藥代動力學的影響，結果表明，柚皮苷不會影響尼索地平口服藥代動力學過程；Edwards等[9]用睪酮作為CYP3A的探針底物，采用大鼠肝微粒體體外研究體系研究了葡萄柚汁、鮮榨酸橙汁和柚皮苷對CYP3A的抑制作用，結果表明，葡萄柚汁抑制CYP3A活性的主要成分不是柚皮苷和柚皮素；Bailey等[10]以12位健康男性為研究對象，研究柚皮苷對非洛地平代謝的影響，結果表明，柚皮苷不是葡萄柚汁與非洛地平發生代謝性相互作用的主要活性物質；Ho等[11]的研究表明，柚皮苷和柚皮素對人肝微粒體CYP3A4有較弱的抑制作用；Kim等[12]的研究表明，柚皮苷可能通過抑制CYP3A的活性而減少維拉帕米在家兔體內的代謝；Choi等[13]的研究表明，柚皮苷可能通過抑制CYP3A和 P-gp而提高他莫西芬在大鼠體內的生物利用度。可見，明確柚皮苷是否會通過影響CYP3A4的代謝活性而與其他藥物產生相互作用，是十分必要的。體內探針底物法是研究CYP450亞型酶活性的重要方法之一，該法通過給予實驗動物CYP450 酶的特異性底物(探針底物)，通過考察藥物或者其他外源性物質對探針底物的主要藥動學參數的影響，間接反映藥物或者其他外源性物質對CYP450 酶活性的誘導或抑制效應[14-15]。

CYP3A4酶的底物眾多，據統計約有150多種藥物，其中，咪達唑侖是美國FDA推薦的常用探針藥物。在大鼠體內，CYP3A1/2與人CYP3A4功能相當[16]，且有著相同的探針底物[15]。因此，本實驗采用體內探針底物法，以咪達唑侖為底物，評價柚皮苷連續7 d給藥后對大鼠肝臟CYP3A1/2活性的影響，為柚皮苷臨床安全合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 試藥 咪達唑侖(純度99.9%，批號：171250-201002，中國食品藥品檢定研究院)；皮質酮(純度98.73%，批號：2750129，德國Calbiochem公司)；甲醇(HPLC級，批號:AH230-4，美國Honeywell B&J公司)；乙腈(HPLC級，批號：AH015-4，美國Honeywell B&J公司)；甲酸(LC-MS級，批號:2017011811A，廣州飛恩新材料科技公司)；肝素鈉(185 USP U·mg-1，上海阿拉丁)；柚皮苷(純度為98.4%，由本團隊委托廣東環球制藥有限公司生產，批號：160901)。

1.2 儀器 1200SL HPLC-6410 Triple Quad 液相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司)；Centrifuge 5430R 臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)；MS105DU 電子分析天平(美國 Mettler Toledo公司)；Arium mini 超純水系統(德國Sartorius公司)；精密移液器(美國Rainin公司)。

1.3 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體重(250±20)g，動物生產許可證號為SCXK(粵)2013-0002。飼養于中山大學生命科學學院時珍堂，實驗動物使用許可證號為SYXK(粵)2014-0020。

2 方法

2.1 溶液與試藥配制

2.1.1 咪達唑侖對照品儲備液的配制 精密稱定咪達唑侖對照品10 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后，加甲醇至刻度線，配制成1 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.1.2 皮質酮(內標)對照品儲備液和內標工作液的配制 精密稱定皮質酮對照品10 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，繼續加甲醇定容，配制成1 mg·mL-1的內標儲備溶液。精密移取內標對照品儲備液400 μL于10 mL棕色容量瓶中，加入70%乙腈定容，配制成40 μg·mL-1的內標工作液。

2.1.3 校正標樣工作液的制備 精密移取適量咪達唑侖對照品儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用70%乙腈稀釋成濃度分別為20 000、8 000、4 000、2 000、800、400、200、100 ng·mL-1的8個不同濃度的校正標樣工作液。

2.1.4 質控樣品工作液的制備 精密移取適量咪達唑侖對照品儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用70%乙腈稀釋成濃度分別為15 000、3 000、240 ng·mL-1的高、中、低濃度質控樣品工作液。

2.1.5 探針藥物咪達唑侖注射溶液的配制 精密稱定咪達唑侖，溶于生理鹽水中，配制成濃度為0.8 mg·mL-1的咪達唑侖注射溶液，用于大鼠尾靜脈注射，現配現用。

2.1.6 柚皮苷混懸液配制 稱取柚皮苷粉末適量，少量多次加入超純水，超聲混勻，制成質量濃度分別為0.01、0.025、0.05和0.1 mg·mL-1的柚皮苷混懸液，供各劑量組大鼠灌胃使用。

2.2 動物分組與給藥 大鼠適應環境3 d后開始實驗。將大鼠隨機分為空白對照組和4個柚皮苷給藥組，每組7只。給藥期間，自由飲水進食。空白對照組的大鼠灌胃給予等體積的超純水，柚皮苷給藥組分別按50、125、250和500 mg·kg-1的劑量灌胃給藥，給藥體積均為5 mL·kg-1，每天1次，連續7 d。最后一次灌胃后，大鼠禁食24 h，然后按2.5 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射咪達唑侖溶液。

2.3 采血與血漿樣品處理 準備1%肝素鈉浸泡、烘干過的1.5 mL離心管和毛細玻璃管，于注射咪達唑侖溶液前及注射后5、10、20、30、45、60、90、120、180和270 min時用毛細玻璃管于大鼠眼底靜脈叢取血0.3～0.4 mL，置于1.5 mL離心管中。全血樣品于室溫下3 500 rpm離心15 min，移取上層血漿100 μL于新的離心管中，備用。

2.4 色譜條件 采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×30 mm，2.7 μm)，柱溫為25 ℃，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，流速為0.4 mL·min-1，進樣量為10 μL。梯度洗脫程序為：0～1.7 min，乙腈40%→46%；1.7～1.8 min，乙腈46%→90%；1.8～2.8 min，乙腈90%；2.8～2.9 min，乙腈90%→40%；2.9～7.0 min，乙腈40%。

2.5 質譜條件 采用電噴霧離子化(ESI)電離、正離子模式檢測、多反應監測(MRM)模式進行，霧化器溫度(Gas temp.)為325 ℃，霧化器流速(Gas flow)為12 L·min-1，霧化器壓力(Nebulizer)為30 psi。待定量的離子對及MRM條件(裂解電壓/碰撞能量)為：咪達唑侖m/z326.1→291.1，205 V/28 eV；皮質酮(內標)m/z347.2→121，140 V/24 eV。

2.6 樣品制備

2.6.1 血漿校正標樣的制備 精密移取空白血漿100 μL，加入不同濃度的校正標樣工作液10 μL，加內標工作液10 μL，混勻，加乙腈280 μL，制成質量濃度分別為500、200、100、50、20、10、5和2.5 ng·mL-1的血漿校正標樣，渦旋1 min，15 000 rpm離心10 min，精密移取上清液100 μL到液相小瓶套管，進樣。

2.6.2 血漿質控樣品的制備 精密移取空白血漿100 μL，加入不同濃度的質控樣品工作液10 μL，加內標工作液10 μL，混勻，加乙腈280 μL，制成質量濃度分別為375、75和6 ng·mL-1的質控樣品，渦旋1 min，15 000 rpm離心10 min，精密移取上清液100 μL到液相小瓶套管，進樣。

2.6.3 分析批的接受標準 一個分析批包括兩條隨行標曲(按“2.6.1”項下的方法制備)、兩份血漿質控樣品(按“2.6.2”項下的方法制備)、待測樣品、空白樣品和零濃度樣品。進樣時，血漿質控樣品均勻分散于分析批中。至少75%的校正標樣的準確度在±15%以內(定量下限在±20%以內)，至少67%的質控樣品且每一濃度水平至少有50%的質控樣品的準確度在±15%以內，則接受該分析批。

2.6.4 血漿樣品的制備 大鼠血漿樣品和零濃度樣品的制備方法為：精密移取待測血漿樣品或空白血漿樣品100 μL，加入內標10 μL，混勻，加70%乙腈10 μL，加乙腈280 μL，渦旋1 min，15 000 rpm離心10 min，精密移取上清液100 μL到液相小瓶的套管，進樣。空白樣品的制備方法為：精密移取空白溶劑樣品100 μL，加入70%乙腈20 μL，加乙腈280 μL，渦旋1 min，精密移取100 μL到液相小瓶的套管，進樣。

2.7 方法學考察

2.7.1 選擇性 按“2.6”項下的方法制備空白血漿樣品和校正標樣中的定量下限樣品，空白血漿來自6只不同的大鼠，進樣分析并評價干擾。

2.7.2 標準曲線及定量下限 按“2.6”項下的方法，在不同天分別制備校正標樣進樣。以目標分析物的濃度(ng·mL-1)為橫坐標，以目標分析物的響應值與內標響應值的比值為縱坐標，采用加權最小二乘法進行擬合，得到咪達唑侖的線性回歸方程。

2.7.3 精密度和準確度 按“2.6”項下的方法制備校正標樣、定量下限樣品及低、中、高濃度質控樣品各6份，以上樣品組成一個分析批，于制備當日進樣分析。第2天、第3天重復制備前述分析批并進樣分析。

2.7.4 殘留 在定量上限樣品進樣后進樣空白血漿樣品來估計殘留。

2.7.5 基質效應 按“2.6”項下的方法，將100 μL的空白血漿替換為100 μL甲醇，制備不含血漿基質的低濃度和高濃度純溶液樣品各1份，進樣。按照“2.6.4”項下的方法，制備低濃度和高濃度基質效應樣品各6份(空白血漿來自6只不同的大鼠，在最后上清液中按照比例加入質控樣品工作液)，進樣分析。計算基質效應樣品和純溶液樣品中目標分析物和內標的基質因子，再以目標分析物的基質因子除以內標的基質因子，得到經內標歸一化的基質因子。

2.7.6 提取回收率 按“2.6”項下方法，制備低濃度質控樣品和高濃度質控樣品各6份，進樣，得到咪達唑侖在低濃度質控樣品和高濃度質控樣品中的響應值(R質控樣品)，按照“2.7.5”項下的方法，制備低濃度和高濃度的基質效應樣品各6份，進樣，得到咪達唑侖在低濃度基質效應樣品和高濃度基質效應樣品中的響應值(R基質效應)，以R質控樣品/ R基質效應得到咪達唑侖的回收率，計算RSD值評價回收率。

2.7.7 穩定性 根據實驗中樣品的儲存時間，需考察樣品在4 ℃儲存24 h和36 h、樣品在自動進樣器溫度下儲存24 h和36 h、樣品在-20 ℃儲存2周和3周共六種不同情況下的穩定性。按照“2.6”項下的方法制備低濃度質控樣品(6 ng·mL-1)和高濃度質控樣品(375 ng·mL-1)各3份，在所評價的儲存條件下儲存后進樣分析，將測得濃度與標示濃度比較。

3 結果

3.1 選擇性 咪達唑侖及皮質酮(內標)的提取離子流圖如圖1所示。由表1可見，干擾組分的響應值低于定量下限樣品中咪達唑侖響應值的20%，并低于內標響應的5%，符合生物樣品定量分析方法的要求。

A.空白血漿樣品；B.空白血漿樣品+混標+內標；C.尾靜脈注射探針底物后1 h的血漿樣品+內標圖1 咪達唑侖及皮質酮(內標)的提取離子流色譜圖

表1 咪達唑侖及皮質酮(內標)在空白血漿樣品和定量下限樣品中的響應值

3.2 標準曲線及定量下限 由表2可見，校正標樣的準確度均在±15%以內，定量下限在±20%以內，符合生物樣品定量分析方法的要求；咪達唑侖在濃度范圍為2.5～500 ng·mL-1的線性回歸方程為Y=0.033X+0.266(r=0.994)，線性良好。

3.3 精密度和準確度 質控樣品的批內和批間精密度均小于15%，批內和批間準確度均在±15%以內，定量下限樣品的批內和批間精密度均小于20%，批內和批間準確度均在±20%以內，符合生物樣品定量分析方法的要求，結果見表3。

表2 血漿校正標樣中測定咪達唑侖的準確度

表3 質控樣品和定量下限樣品的準確度和精密度

3.4 殘留 由表4可見，在定量上限樣品后所注射的空白樣品中，咪達唑侖的殘留值不超過定量下限的20%，且不超過內標的5%，符合生物樣品定量分析方法的要求。

表4 咪達唑侖和皮質酮(內標)在空白血漿樣品中的殘留值

3.5 基質效應 進樣分析結果表明，低濃度和高濃度質控樣品中咪達唑侖從6批基質計算的內標歸一化的基質因子的變異系數分別為5.65%、4.54%，均小于15%，表明基質效應符合生物樣品定量分析方法的要求。

3.6 提取回收率 提取回收率實驗結果見表5，由表5可見，低濃度樣品和高濃度樣品的平均提取回收率分別為80.02%、78.19%，RSD值分別為3.94%、4.18%，均小于15%，表明提取回收率符合生物樣品定量分析方法的要求。

3.7 穩定性 由表6可見，血漿樣品在4 ℃儲存24 h和36 h、樣品在自動進樣器溫度下放置24 h和36 h、樣品在-20 ℃儲存2周和3周共6種不同情況下，所測得的咪達唑侖濃度的準確度均在±15%范圍內，表明穩定性良好。

表5 血漿樣品中咪達唑侖的提取回收率

3.8 藥動學參數 各組咪達唑侖的平均藥時曲線見圖2、藥動學參數見表7。由表7可見，與對照組比較，柚皮苷4個劑量組的咪達唑侖的藥代動力學參數AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t、MRT0～∞、t1/2、V、Cl和Cmax均無顯著性差異(P>0.05)。說明口服劑量在50～500 mg·kg-1范圍內的柚皮苷給藥7 d對大鼠體內CYP3A4活性無明顯影響。

表6 血漿樣品中咪達唑侖的穩定性考察

圖2 咪達唑侖的平均藥時曲線圖(n=7)

4 討論

近年來，柚皮苷因具有廣泛的藥理活性而受到關注，大量研究表明，柚皮苷或柚皮素具有抗骨質疏松、抗氧化、改善神經功能障礙、抗炎、改善糖脂代謝紊亂、抗動脈粥樣硬化、免疫調節、抗癌等多種藥理作用[17-18]。由于柚皮苷廣泛存在于葡萄柚、桔、橙等水果植物及化橘紅、骨碎補、枳實、枳殼、橘紅、菝葜、枸櫞等中藥材中[6-7]，因此，研究柚皮苷與其他藥物之間的相互作用是十分必要的。

表7 咪達唑侖藥代動力學參數(n=7)

在藥物代謝研究中，液相色譜串聯質譜法應用廣泛，其具有操作簡單、分析速度快、所需樣品量少、靈敏度高、特異性好、結果可靠、重現性好等特點[19]。本文根據《中國藥典》2015年版(四部)中的“9012-生物樣品定量分析方法驗證指導原則”，采用一種基于探針底物法和高效液相串聯質譜法的方法來測定大鼠血漿中咪達唑侖的含量，評價了柚皮苷對大鼠肝臟細胞色素P450 同工酶CYP3A1/2代謝活性的影響，結果表明，與對照組比較，柚皮苷四個劑量組(50、125、250和500 mg·kg-1)的咪達唑侖的主要藥代動力學參數AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t、MRT0～∞、t1/2、V、Cl和Cmax均無顯著差異，說明柚皮苷連續灌胃給藥7 d(給藥劑量在50～500 mg·kg-1范圍內)對大鼠肝臟CYP3A1/2酶活性無明顯影響。有文獻報道[20]，柚皮苷及其苷元柚皮素會抑制腸道某些藥物轉運體(OATPs轉運體、P-gp)的活性，因此，為排除柚皮苷可能對探針藥物咪達唑侖的吸收產生復雜的影響，在本實驗中，咪達唑侖采用靜脈注射的方式給藥。

由于CYP3A4亞型酶的表達調控機制存在明顯種屬差異[21]，因此，不能簡單地由動物實驗結果外推到人體。關于柚皮苷對人體內CYP3A4亞型酶活性的影響，仍需要進一步研究并加以驗證。