蛋白酶激活受體拮抗劑在抗血小板領域的研究進展

李杉杉，朱雄

(中國藥科大學，江蘇 南京 210009)

動脈粥樣硬化所形成的血栓性疾病是全世界發病率和死亡率較高的疾病之一，臨床上主要表現為：急性冠狀動脈綜合征、腦血管事件和外周動脈疾病。其中血小板活化和聚集是導致動脈粥樣硬化性疾病形成以及臨床表現的主要原因[1]。目前，臨床上治療治療血栓性疾病的標準治療方案是阿司匹林聯合P2Y12二磷酸腺苷(ADP)受體抑制劑氯吡格雷的雙重口服治療，并且此治療方案可顯著改善動脈粥樣硬化疾病患者的預后[2]。然而，阿司匹林和氯吡格雷不僅抑制血小板活化途徑，還可影響人體中其他的正常代謝途徑[3]。并且，阿司匹林和氯吡格雷存在個體差異性和較為嚴重的出血事件限制了臨床上的使用。凝血酶可以不斷地刺激血小板的活化和血栓的形成，被認為是最強的血小板活化因子。因此，開發更有效地抑制血小板的活化而不增加出血并發癥的抗血小板藥物是當下血栓性疾病治療領域存在的主要瓶頸。在臨床前模型研究和小規模臨床試驗中發現蛋白酶激活受體(PARs)拮抗劑可抑制凝血酶介導的血小板活化，同時不增加出血風險[4]。

凝血酶(thrombin)是一種絲氨酸蛋白酶，除了促進凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅺ產生以及裂解纖維蛋白原轉化為纖維蛋白外，同時也是血小板活化最強的激動劑之一[5]。凝血酶活化血小板涉及G蛋白偶聯的七次跨膜受體，主要與血小板初期的聚集有關。人體血小板的活化主要是通過凝血酶介導的PAR-1和PAR-4受體進行的[6]。在人類血小板中，PAR-1是主要的凝血酶受體，PAR-1在凝血酶濃度僅有納摩爾級時即可活化血小板，而PAR-4則需要更高濃度的凝血酶才可激活血小板[7-8]。

1 PARs及其激活機制

PARs是細胞表面的一種G蛋白偶聯受體，屬于G蛋白偶聯受體超家族成員之一。同其他G蛋白偶聯受體一樣，PARs也具有單鏈七次跨膜的特性。近20年來，PARs共有4種蛋白酶激活受體被發現，分別是PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4。其中人類血小板表達PAR-1和PAR-4，而嚙齒類動物表達PAR-3和PAR-4，而不表達PAR-1[9]。

1.1 PAR-1的生物學結構 PAR-1是最早發現的PARs家族成員，是凝血酶的主要受體，也是目前研究最多的蛋白酶活化受體。如圖1所示，PAR-1位于細胞膜上，由胞外區(N-末端)、7個疏水跨膜螺旋以及胞內區(C末端)3個部分組成，共有425個氨基酸殘基[10]。

圖1 人類凝血酶受體PAR-1結構[11]

1.2 凝血酶激活PAR-1機制 凝血酶含有3個不同的區域，一個活性位點和兩個外結合位點。凝血酶的兩端為帶正電荷的外結合位點，PAR-1的N末端的酸性區能與外結合位點結合,這個酸性區含有類水蛭素的結合位點，可增強其對凝血酶的親和力[12]。如圖2所示，凝血酶的外結合位點結合血小板表面上PAR-1的水蛭素樣的胞外氨基末端結構域，切割41位精氨酸和42位絲氨酸之間的受體，去除氨基末端序列并產生一個新的鎖系質子化的氨基配體—SFLRRN(絲氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-天冬氨酸)[13]，這個新產生的N末端的鎖系配體(tethered ligand)與受體發生分子內結合而產生跨膜信號從而激活PAR-1受體[14]。水蛭素樣序列主要存在于PAR-1和PAR-3中，在低凝血酶濃度條件下，其對于受體的切割十分重要。而PAR-4沒有促凝血酶結合的類水蛭素結合位點，因而對凝血酶的親和力遠低于PAR-1，所以PAR-4的激活需要更高的凝血酶濃度[15]。

圖2 凝血酶激活PAR-1機制[16]

1.3 PAR-2和PAR-3在血小板活化中的作用 PAR-2和PAR-1結構相似，含有7個跨膜螺旋結構域，N末端位于胞外，有相應受體的蛋白酶裂解位點，C末端在胞內調控受體脫敏和信號傳導。然而由于PAR-2裂解位點沒有PAR-1中供凝血酶結合的酸性區域，不能被凝血酶激活，而是由胰蛋白酶激活[17]。PAR-3是繼PAR-1之后第二個被發現的凝血酶受體，研究發現凝血酶還可裂解PAR-3，然而這種相互作用的生理機制尚未探究清楚[18]，PAR-3還可與其他PARs發生二聚化，這種行為可能有助于PAR-4的信號調節，因而PAR-3被認為是PAR-4的輔助因子，可增加凝血酶對PAR-4的親和力[19]。

1.4 凝血酶激活PAR-4機制 PAR-4由385個氨基酸組成，包含一個信號肽和一個胞外N末端Arg/Gly/Ser蛋白酶結合位點，PAR-4的激活原理同PAR-1相似：首先PAR-4的胞外N末端與凝血酶相結合，凝血酶切割其末端并產生新的N末端即鎖系配體，這個新產生的鎖系配體與胞外第二環結合形成閉環，進而激活受體并引起一系列信號通路。如圖3所示，但是與PAR-1有所不同，由于PAR-4沒有促凝血酶結合的類水蛭素結合位點，需要較高濃度的凝血酶PAR-4才可激活。當PAR-3和PAR-4同時表達時，在較低濃度的凝血酶條件下PAR-3可作為輔助因子提高PAR-4的敏感度，有助于PAR-4的裂解和活化[20]。

圖3 凝血酶激活PAR-4以及輔助因子PAR-3參與的調節機制[19]

2 PAR-1和PAR-4作為抗血小板聚集治療靶點的優勢

2.1 現有臨床藥物的局限性 目前臨床上心腦血管疾病標準的治療方案是阿司匹林聯合氯吡格雷的雙重口服的抗血小板治療。阿司匹林是不可逆的COX-1抑制劑，通過減少TXA2的生成從而抑制血小板過度聚集，達到防止血栓生成的目的[21]。氯吡格雷通過與P2Y12不可逆結合，抑制P2Y12受體活性，從而抑制血小板聚集[22]。兩種藥物聯合使用能夠有效地抑制血小板聚集，防止血栓的生成，降低心腦血管的發病率。但是該治療方案可以引起嚴重的出血事件，并且出血風險隨劑量的依賴性而增加；其次除了出血風險之外，相當多的患者在接受雙重抗血小板治療之后更容易產生反復的血栓形成事件[23]。因此對于具有強效和低出血風險的抗血小板藥物仍存在大量的臨床需求。

2.2 PARs拮抗劑的優勢 凝血酶介導的人類血小板活化的過程中，PAR-1和PAR-4發揮著明顯不同的作用。PAR-1對凝血酶的親和力高，激活所需要的凝血酶濃度較低；相反PAR-4是一種低親和力的凝血酶受體，需要較高濃度的凝血酶來激活。PAR-1和PAR-4在人體內的動力學過程不同，并且參與了血小板活化的不同階段。凝血酶激活PAR-1產生快速而短暫的鈣離子信號[24-25]，進而引發受體的再分配和信號傳導的終止,而PAR-4的活化速度比PAR-1慢20～70倍，并且所引發的鈣信號持續時間較長[26]。有理論研究認為，在凝血酶濃度較低的初始情況下，PAR-1的激活是參與止血過程的主要因素；而在高凝血酶濃度的條件下血小板活化的后期階段以閉塞性血栓的形成為主，這個過程主要是由PAR-4介導完成的[27]。PARs拮抗劑并不影響凝血酶切割纖維蛋白酶的功能，相比于其他的凝血酶抑制劑，PARs拮抗劑不容易引起出血并發癥，且具有更為寬闊的治療窗[28]。因此PAR-1和PAR-4作為靶點開發新的抗血小板聚集藥物具有較大的前景，如表1所示，PAR-1和PAR-4拮抗劑的臨床研究進展。

表1 PAR-1和PAR-4拮抗劑臨床研究進展

3 PAR-1拮抗劑的研究進展

PAR-1拮抗劑：如圖4所示，目前報道的PAR-1小分子拮抗劑主要包括Vorapaxar、Atopaxar、F-16618、F-16357、ML-161、RWJ-52859、PZ-128等。

圖4 PAR-1拮抗劑

3.1 Vorapaxar Vorapaxar由默沙東研發，2014年5月經FDA批準上市，是首個通過抑制凝血酶受體的活性來治療血栓的藥物。研究顯示，Vorapaxar對PAR-1具有良好的拮抗活性，能顯著降低心肌梗死的發病率。然而當患者患有中風史或者短暫性腦缺血發作史時，Vorapaxar會增加顱內出血的風險[29]。而且沒有合適的可逆轉Vorapaxar的抗血小板的藥物，2016年8月，默沙東宣布停止在美國繼續推廣Vorapaxar的臨床使用。

3.2 Atopaxar Atopaxar又名E5555，由日本衛材株式會社研發的可逆性口服PAR-1拮抗劑。臨床前研究表明:Atopaxar可有效抑制凝血酶誘導的血小板聚集反應(IC50=64 nmol·L-1)，表現出強有力的血小板抑制作用，同時不會增加出血時間[30]。然而在Ⅱ期臨床的高劑量組試驗中，發現了Atopaxar可引起肝功能異常和QT間期延長的現象，并且缺乏明顯的量效關系，故已終止了Atopaxar的開發[31]。

3.3 RWJ-58259 RWJ-58259由強生公司研發的選擇性PAR-1拮抗劑。在體外活性測試中，發現RWJ-58259可有效抑制人體凝血酶介導的血小板聚集(IC50=0.37 μmol·L-1)[32]。然而藥動學性質較差使其止步于臨床前研究。

3.4 F-16618、F-16357 F-16618、F-16357是法國Pierre Fabre 研究中心開發的PAR-1 拮抗劑。體外研究表明F-16618、F-16357可有效抑制凝血酶受體活性肽誘導的血小板聚集，并且在大鼠的體外動靜脈模型中均表現出一定的抗血栓活性，對PAR-1有一定選擇性[33]。F-16618、F-16357藥動學性能良好，目前尚未有更多的臨床信息披露。

3.5 ML-161 ML-161是由Dockendorff等[34]通過高通量篩選發現的新型PAR-1拮抗劑。臨床前研究表明ML-161能夠顯著抑制由凝血酶受體活性肽誘導的人血小板表面P-selectin 蛋白的表達，且僅抑制了血小板的分泌反應，而不改變血小板的正常形態。這種新的作用機制可能降低臨床上出血等不良事件的發生，目前尚未有更多臨床信息披露。

3.6 PZ-128 PZ-128由Tufts Medical Center開發的高效、可逆轉的多肽類PAR-1拮抗劑，I期臨床顯示PZ-128對由凝血酶受體活性肽(8 μmol·L-1)誘導的血小板聚集反應具有明顯效果，并且呈劑量相關性[35]。2018年4月24日披露信息顯示其暫停了一項名為“PZ-128在接受非急診經皮冠狀動脈介入治療(TRIP-PCI)的患者中的安全性”的Ⅱ期臨床實驗，暫停原因尚不明確。

4 PAR-4拮抗劑研究進展

近二十年來，圍繞PAR-4特有的生理機制，研究人員通過生物電子等排、高通量篩選等技術設計合成了3種不同結構類型的小分子的PAR-4拮抗劑，主要包括吲唑、吲哚、咪唑并噻二唑類結構。

4.1 吲唑類 2001年，我國臺灣的研究工作者Lee等[36]發現YC-1對由凝血酶、花生四烯酸、膠原蛋白以及血小板活化因子引起的血小板聚集具有顯著的抑制作用[37]。如圖5所示，在YC-1的基礎上設計合成了一系列吲唑苯甲酸類化合物，并對其進行了活性篩選。如改造的過程中發現YD-3對由凝血酶介導的血小板聚集有很強的抑制作用(IC50=29.3 μmol·L-1)[38]，而對花生四烯酸、膠原蛋白、血小板活化因子等沒有抑制作用。YD-3可以選擇性地抑制凝血酶誘導的血小板聚集和磷酸肌醇的分解而不影響凝血酶正常的蛋白水解活性，研究人員在深入的研究中發現YD-3并非是PAR-1受體拮抗劑，而是一種非肽類的PAR-4受體拮抗劑。然而由于YD-3的高親脂性限制了其在體外實驗中的應用。由此研究人員以YD-3作為先導化合物對其進行結構改造和構效關系的研究。

圖5 YC-1和YD-3的化學結構

2008年，研究者在對YD-3進行構效關系的探索中發現[39]，C3位苯環上的乙酯基和N1位上的芐基對于抗PAR-4活性是重要的藥效基團，二者缺少其中的任一部分均可導致活性喪失；C3位上的乙酯基被其他酯、酰胺或者羧酸基團取代時活性降低；N1位上芐基引入鹵素或者甲氧基可增加對PAR-4受體的選擇性。

4.2 吲哚類 2013年，Wen等[29,40]在YD-3的基礎上將吲唑環改為吲哚環，設計合成了比YD-3活性更好的化合物SEY-3(IC50=66 nmol·L-1)，并在Vanderbit大學的化合物庫中進一步篩選出與SEY-3結構類似的化合物ML-354(IC50=140 nmol·L-1)。由于毒理學和藥代動力學等方面的因素，研究者繼續以ML-354為先導化合物進行結構修飾和構效關系的研究，化合物結構如圖6所示。

圖6 化合物SEY-3和ML-354化學結構

同時，Temple等[41-42]在ML-354的基礎上也引入了咪唑并噻二唑的結構，得到了更優的活性和體內藥代動力學參數，并且對γ-凝血酶(γ-thrombin)有很好的抑制作用。研究發現VU0661259(IC50=179 nmol·L-1)的藥理活性比由ML-354修飾而來的化合物1活性更好，在結構修飾以及尋找最小藥效團的過程中，研究者將VU0661259 的C2位引入咪唑并噻二的結構來替代羥甲基的結構,得到了對PAR-4 活性肽(PAR-4 Activating Peptide，PAR-4 AP) IC50=20 nmol·L-1的化合物2，化合物結構如圖7所示。這些工作為后期的具有成藥性的化合物提供了重要的借鑒意義。

4.3 咪唑并噻二唑類 2013年，施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb，BMS)也對PAR-4拮抗劑展開了大量的研究工作并申請的大量的專利[43-45]。在對大量咪唑并噻二唑化合物的合成和篩選過程中，發現了UDM-001651、UDM-002555、

BMS-986141、BMS-986120(見圖8)等化合物對PAR-4引起的血小板聚集具有優良的抑制作用。

圖7 化合物1～2、VU0661259化學結構

圖8 BMS開發的PAR-4拮抗劑化學結構

UDM-001651和UDM-002555均已完成臨床前研究，其中UDM-001651和UDM-00255的體外研究中對于拮抗人體PAR-4 AP IC50值分別為2.42和1 nmol·L-1，目前已作為一種工具藥物檢測PAR-4激動肽的活性。

BMS-986120是一種口服強效、可逆、選擇性好的小分子PAR-4受體拮抗劑，BMS-986120可選擇性地抑制PAR-4受體，而對一系列凝血蛋白酶和多種受體、酶以及離子通道均無抑制活性。在體外實驗中，BMS-986120對γ-凝血酶的IC50=7.3 nmol·L-1，而在人類全血中的PAR-4 AP IC50=9.5 nmol·L-1。BMS-986120已完成Ⅰ期臨床實驗，臨床結果表明BMS-986120具有很強的劑量依賴性的抗血栓活性，且藥代動力學數據可接受，相比于標準抗血小板藥物氯吡格雷BMS-986120表現出較低的出血風險和更寬的治療窗口。目前BMS-986120已進入Ⅱ期臨床。

BMS-986141也是口服小分子PAR-4受體抑制劑，用于預防急性缺血性腦卒中或接受阿司匹林治療后的短暫性腦缺血以及復發性的腦梗死[46]。其體外對血小板聚集反應的IC50達0.33 μmol·L-1。2017年在Ⅱ期臨床中因為存在較高比例的不良反應已終止開發。

5 總結與展望

近年來，抗血小板藥物的開發已成為當下心腦血管疾病領域的研究熱點。雖然出現了各種不同機制的抗血小板藥物，但臨床上不良反應的發生率仍然很高。PAR-1和PAR-4已成為抗血小板藥物研發的新靶點，目前PAR-1受體拮抗劑Vorapaxar雖已上市，但出血事故的發生比例較高，限制了其在臨床上的應用。近期研究發現藥物靶向拮抗PAR-4受體時，發生出血的不良反應較低，針對PAR-4的小分子拮抗劑有可能成為安全有效的抗血小板藥物,具有廣闊的市場前景。但PAR-4受體拮抗劑存在藥代動力學參數較差，成藥性不好等問題。目前僅施貴寶公司研發的藥物BMS-986120進入臨床Ⅱ期。相信隨著對PAR-1和PAR-4靶點的不斷深入以及相關拮抗劑結構的優化，抗血小板治療領域將會取得巨大的突破。