仙靈密骨顆粒質量標準的研究

劉群，邱少華，林曉

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101：2.臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 276000)

本品是由續斷、淫羊藿等味藥材經合理的工藝提取得到的顆粒劑，具補腎益精、強筋健骨、活血通絡之功效，用于骨質疏松癥中證屬“腎虛絡瘀”者。其中淫羊藿，又名仙靈脾，能溫腎壯陽、強筋骨、祛風濕，為方中君藥[1]。現代藥理研究亦表明，淫羊藿苷作為淫羊藿的主要有效成分，能顯著促進成骨細胞增殖[2]。為了能科學有效地控制本品的內在質量，本研究選擇淫羊藿苷作為高效液相色譜(HPLC)含量測定指標，同時對雞血藤、淫羊藿、骨碎補、續斷、千年健進行薄層色譜(TLC)鑒別研究，建立了仙靈密骨顆粒的定性定量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司，包括VWD檢測器、Chemstation色譜工作站)；Mettler Toledo AG285電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ5200DB數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，160 W，40 kHz)；硅膠G薄層板(青島海浪硅膠干燥劑有限公司)。

1.2 試藥 淫羊藿苷對照品(批號：0737-200011)、柚皮苷對照品(批號：722-200107)、川續斷皂苷VI對照品(批號：111685-200401)、雞血藤對照藥材(批號：121173-200402)、千年健對照藥材(批號：121571-201202)購自中國食品藥品檢定研究院。顆粒樣品3批(批號：100104、100108和100112)。乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、三氯甲烷及其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 雞血藤[3]取本品8 g，研細，加甲醇60 mL，回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加熱水20 mL使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取不含雞血藤的陰性制劑，同法制成雞血藤陰性對照溶液。再取雞血藤對照藥材5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中國藥典》2015年版(四部)通則0502]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。從圖1中可以看出，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性對照液在與對照藥材色譜相應的位置上無相同顏色的熒光斑點出現，表明陰性對照液對雞血藤的鑒別無干擾，該法簡便，快速，并具有良好的專屬性。

1、4.雞血藤對照藥材溶液；2.陰性對照液；3.供試品溶液圖1 雞血藤的TLC鑒別色譜圖

2.1.2 淫羊藿、骨碎補[3-4]取上述“2.1.1”項下三氯甲烷提取后的水液，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另分別取不含淫羊藿和不含骨碎補的陰性制劑，同法制成淫羊藿陰性對照溶液和骨碎補陰性對照溶液。再取淫羊藿苷對照品、柚皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[《中國藥典》2015年版(四部)通則0502]試驗，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置105 ℃烘箱中加熱5 min，取出，置紫外光燈(365 nm)下檢視。從薄層色譜圖(見圖2)上可以看出，供試品色譜中，在與淫羊藿苷和柚皮苷對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性對照液在與對照品色譜相應的位置上無相同顏色的熒光斑點出現，表明陰性對照液對淫羊藿苷和柚皮苷的鑒別無干擾，該法具有良好的專屬性。

1.淫羊藿苷；2.缺淫羊藿陰性對照液；3.供試品溶液；4.缺骨碎補陰性對照液；5.柚皮苷圖2 淫羊藿、骨碎補的TLC鑒別色譜圖

2.1.3 續斷[5-6]取“2.1.2”項下乙酸乙酯提取后的水液，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨水層，正丁醇層再用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，加中性氧化鋁(100～200目)1 g拌勻，揮干溶劑，加于中性氧化鋁柱(100～200目，7 g，d=1.5 cm，干法裝柱)上，用水30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取不含續斷的陰性制劑，同法制成續斷陰性對照溶液。再取川續斷皂苷VI對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[《中國藥典》2015年版(四部)通則0502]試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一以0.5% NaOH溶液制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。從薄層色譜圖(見圖3)上可以看出，供試品色譜中，在于對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性對照液在與對照品色譜相應的位置上無相同顏色的斑點出現，表明陰性對照液對川續斷皂苷VI的鑒別無干擾，該法簡便，快速，并具有良好的專屬性。

1、4.川續斷皂苷VI對照品；2.陰性對照液；3.供試品溶液圖3 續斷的TLC鑒別色譜圖

2.1.4 千年健[7]取本品8 g，研細，置250 mL圓底燒瓶中，加水100 mL，搖勻，上接揮發油測定器，自測定器上端加水使充滿其刻度部分，再于刻度管中加入乙酸乙酯4 mL，連接回流冷凝管，加熱至沸，蒸餾1 h，分取乙酸乙酯層，作為供試品溶液。另取不含千年健的陰性制劑，同法制成千年健陰性對照溶液。再取千年健對照藥材2 g,加乙醚20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中國藥典》2015年版(四部)通則0502]試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。從薄層色譜圖(見圖4)上可以看出，供試品色譜中，在于千年健對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性對照液在與對照藥材色譜相應的位置上無相同顏色的斑點出現，表明陰性對照液對千年健的鑒別無干擾，結果表明，該法簡便、專屬性強。

1、4.千年健對照藥材；2.陰性對照液；3.供試品溶液圖4 千年健的TLC鑒別色譜圖

2.2 淫羊藿苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(30∶70)為流動相，流速1.0 mL·min-1，檢測波長270 nm，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。理論板數按淫羊藿苷峰計算不低于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含0.105 6 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品，研細，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，濾過，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用50%的甲醇使溶解并轉移至25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例，取除淫羊藿以外的其他處方量藥材，按處方制劑工藝同法制備缺淫羊藿的陰性對照樣品，取陰性對照樣品適量，按“2.2.3”項下同法制成陰性對照溶液。

2.2.5 系統適應性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣。結果表明陰性樣品在淫羊藿苷出峰位置上無雜質峰，表明處方中其他藥味對淫羊藿苷的含量測定無干擾(見圖5)。

A.對照品；B.供試品；C.陰性對照 1.淫羊藿苷圖5 淫羊藿苷HPLC色譜圖

2.2.6 線性關系考察 精密吸取上述對照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分別置于2 mL量瓶中，以50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸分析，回歸方程為Y=19.833×103X-6.223(r=0.999 9)，表明淫羊藿苷在進樣濃度0.015 84～0.079 20 mg·mL-1范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取“2.2.6”項下同一對照品溶液(濃度為0.047 52 mg·mL-1)，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，結果峰面積RSD為0.11%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、1、2、4、6、8 h按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定淫羊藿苷峰面積。結果峰面積RSD為0.69%，表明供試品溶液在8 h內測定是穩定的。

2.2.9 重復性試驗 取同一批樣品(批號：100108)6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，結果淫羊藿苷平均含量為1.260 mg·g-1，RSD為0.32%，表明本方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批樣品(批號：100108，淫羊藿苷含量為1.260 mg·g-1)6份，每份1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入淫羊藿苷對照品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收率試驗結果

2.2.11 樣品測定 取上述3批樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，每批平行測定2次，結果見表2。

表2 3批顆粒中淫羊藿苷含量測定結果

3 討論

3.1 薄層色譜條件的選擇 在對處方中雞血藤、淫羊藿、骨碎補、續斷4味藥材進行TLC定性鑒別時，根據上述藥材所含化學成分的性質差異，在供試樣品制備中，實現了以同一份樣品的三氯甲烷部位用于雞血藤鑒別，乙酸乙酯部位用于淫羊藿、骨碎補鑒別，正丁醇部位用于續斷鑒別的實驗操作，也可減少試劑對環境的污染。其中在雞血藤供試品處理上，把樣品的三氯甲烷提取液蒸干后，芒柄花素在熱水中溶解較好，所以以熱水溶解，濾過，可除去大量葉綠素等脂溶性雜質，減少了干擾，使斑點顯色更為清晰；在其展開劑的選擇上，參考《中國藥典》[3]，并把三氯甲烷-甲醇比例由10∶1調整為20∶1，使得薄層斑點間分離度進一步得到改善。在續斷供試品處理上，參考文獻報道[5-6]，選擇鑒別續斷中的有效成分川續斷皂苷VI，并通過甲醇回流提取，三氯甲烷、乙酸乙酯脫脂，正丁醇萃取，氨試液洗滌，中性氧化鋁柱凈化等操作，有效地消除了雜質成分干擾，使薄層色譜清晰可辨；同時，在本項試驗中，曾嘗試采用藥典色譜條件，即以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)上層溶液為展開劑，采用硅膠G薄層板，結果卻因供試品中川續斷皂苷VI受其上方一黃色斑點干擾，使得對照品與供試品色譜行為不甚一致，且存在斑點拖尾現象，通過采用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑進行展開試驗，仍無法解決，經摸索以 NaOH溶液制備的硅膠G薄層板展開，得到的結果較好，而以0.5%NaOH溶液制備的硅膠G薄層板得到的色譜為最好。在對處方中千年健藥材進行TLC定性鑒別時，由于制劑中千年健揮發油采用倍他環糊精包合，其中揮發性成分采用乙醚直接提取效率較低，影響色譜結果判斷；而通過揮發油提取器提取，樣品成分提取效率得到提高，色譜斑點明顯，對照藥材用乙醚提取則可。

3.2 淫羊藿苷含量測定條件的確定 關于淫羊藿中淫羊藿苷的含量測定及提取文獻報道[2,8]較多，供試品溶液的制備多選用乙醇或甲醇為提取溶劑，超聲或回流提取，再以聚酰胺處理或以乙酸乙酯萃取，本文優選以甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，再用乙酸乙酯萃取，既能保證制劑中的淫羊藿苷被提取完全，也盡可能地減少雜質對淫羊藿苷測定的干擾。采用《中國藥典》2015年版(一部)淫羊藿含量測定項下的乙腈-水(30∶70)為流動相，以270 nm為檢測波長，即可滿足淫羊藿苷的分離[9]。經過試驗驗證，本文所建立的方法能較好地應用于顆粒的質量控制。