泊洛沙姆407修飾吉非替尼脂質體的制備及抗腫瘤活性研究

王洪濤，劉照容，王敬磊，王方，張彥卓

(徐州醫科大學，江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

吉非替尼(gefitinib,GFB)是一種選擇性作用于表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑[1-2]，可以競爭性地結合EGFR胞內ATP位點，阻斷信號傳導，抑制腫瘤細胞的繁殖、轉移，發揮靶向作用[3]。GFB臨床上作為抗晚期非小細胞肺癌治療的藥物，市售制劑為片劑，由于首過效應、P-糖蛋白外排作用，存在生物利用度低、個體差異大、胃腸道不良反應隨劑量增加而加重等問題[4-5]。

脂質體是一類將藥物包封于類脂質雙分子層內形成的微型囊泡體，主要成分為磷脂、膽固醇，具有無毒、無免疫原性、生物相容性好的特點。難溶性藥物包埋于脂質雙分子層中，有利于提高難溶藥物的溶解度[6-7]。脂質體通過吸附、融合、內吞等方式被細胞攝取，實現藥物的胞內遞送[8-9]。但僅由磷脂、膽固醇形成的脂質體穩定性差、包封率較低，限制了體內外運用。泊洛沙姆407是由聚氧乙烯和聚氧丙烯組成的嵌段聚合物，中間為疏水聚氧丙烯嵌段，兩側為親水性聚氧乙烯嵌段，具有良好的兩親性，可與生物膜材料良好相容[10]，同時對P-糖蛋白介導的藥物外排作用有抑制效果[11]。泊洛沙姆407與磷脂形成脂質體時，可增加脂質體的強度，同時作為表面活性劑可提高藥物的溶解度[12]。本課題制備泊洛沙姆407修飾的吉非替尼脂質體(GFB-PML)，通過泊洛沙姆407的修飾增加藥物溶解性、包封率，發揮脂質體的被動靶向與吉非替尼的分子靶向的雙重作用，通過細胞毒性實驗與小鼠體內腫瘤生長實驗考察GFB-PML的腫瘤抑制效果，為吉非替尼的新劑型研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 RE-2000B旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SH2-CA循環水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；SB-5200超聲波清洗機(寧波新芝生物科技公司)；MS104S/01分析天平(梅特勒-托利多公司)；Nicomp 380/ZLS納米粒度及Zeta電位測定儀(美國PSS公司)；FD-1C-50冷凍干燥機(北京博醫實驗儀器公司)；CKX31顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；SHZ-82A數顯恒溫振蕩器(金壇區白塔新寶儀器廠)；H1850臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.1.2 試藥 大豆卵磷脂(上海阿拉丁試劑公司，批號：G1813018)；膽固醇(上海阿拉丁試劑公司，批號：G12600)；泊洛沙姆407(巴斯夫股份公司，批號：WPW1603B)；吉非替尼原料藥(南京亞東啟天藥業有限公司，批號：180420)；吉非替尼對照品(南京亞東啟天藥業有限公司，批號：180309)；透析袋(上海源葉生物科技公司，MCWO 8000-14000)；超濾管(北京拜爾迪生物技術有限公司，MWCO 10K)；噻唑藍(MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(凱基生物技術股份有限公司，批號：20180413)；香豆素-6(北京百靈威科技有限公司，批號：LPC0R06);赫斯特熒光染料33342(上海阿拉丁試劑公司，批號：11318001)；羅丹明標記鬼筆環肽(翎盛科技有限公司，批號：T03598)；乙腈、乙酸銨為色譜純；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 細胞及動物 人肺癌細胞A549、小鼠肝癌細胞H22購于中國科學院上海細胞庫；昆明小鼠，雌性，體重(20±5)g，購于徐州醫科大學動物實驗中心，生產許可證號：SYXK(蘇)2010-0011，常規飼養1周后進行造模。

1.2 方法

1.2.1 GFB-PML的制備 采用薄膜分散-水化法制備GFB-PML。即稱取磷脂20 mg、膽固醇6 mg、泊洛沙姆407 10 mg、GFB 5 mg，置于100 mL茄形瓶中，加入30 mL無水乙醇超聲溶解。50 ℃下旋轉蒸發除去乙醇，待形成薄膜后，加入5 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液，超聲水化，得到脂質體混懸液。將脂質體混懸液過0.45 μm微孔濾膜，即得GFB-PML溶液。空白泊洛沙姆修飾脂質體(PML)處方中不含GFB，其他制備過程保持一致。將GFB-PML溶液轉移至培養皿中，-20 ℃預凍12 h后，于冷凍干燥機內凍干24 h，得GFB-PML凍干粉。

1.2.2 GFB-PML內藥物的測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18柱(4.66 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-乙酸銨水溶液(51∶49，乙酸銨濃度為0.01 mol·L-1)，流速為1 mL·min-1，柱溫35 ℃，紫外檢測波長247 nm，進樣量20 μL。

1.2.2.2 GFB標準曲線的制備 精密稱取GFB對照品10.00 mg，溶于100 mL乙腈中，配成100 μg·mL-1的GFB儲備液。分別吸取上述溶液適量，乙腈稀釋至終濃度為0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 μg·mL-1的溶液。高效液相色譜儀進樣，記錄峰面積。

1.2.2.3 精密度試驗 分別配制0.1、1、50 μg·mL-1的GFB溶液，于同一天內重復測定5次，計算日內相對標準偏差。重復測定3 d，計算日間相對標準偏差。

1.2.2.4 回收率試驗 取9份1 mL制備的PML溶液，加至25 mL容量瓶內，分別加入適量“1.2.2.2”項下GFB儲備液，每組3份，乙腈定容至刻度線，制成低、中、高(0.2、2.0、10.0 μg·mL-1)濃度的供試品溶液。進液相測定峰面積，與同濃度GFB標準溶液測定峰面積進行比較，計算回收率。

1.2.3 GFB-PML的質量研究

1.2.3.1 粒徑和Zeta電位的測定 吸取適量制備的GFB-PML溶液，用去離子水稀釋數倍并超聲分散，用Nicomp380/ZLS型納米粒度與Zeta電位測定儀測定粒徑、PDI值、Zeta電位，重復測定3次。

1.2.3.2 GFB-PML載藥量與包封率的測定 稱取10 mg GFB-PML凍干粉，記錄質量m1。加5 mL乙腈超聲20 min破乳，轉移至25 mL容量瓶并定容，過0.45 μm微孔濾膜后按“1.2.2.1”項下色譜條件進行液相檢測，記錄峰面積，對應濃度為C0。按以下公式計算載藥量：載藥量(%)=(25C0×10-3/m1)×100%。吸取500 μL GFB-PML溶液，加至超濾管中，9 500 rpm離心30 min，吸取濾過液，按“1.2.2.1”項下色譜條件進行液相檢測，記錄峰面積，對應游離濃度C1。同時吸取500 μL GFB-PML溶液加至25 mL容量瓶中，加乙腈定容，進樣并計算總濃度C2。按以下計算包封率：包封率(%)=(1-C1/50C2)×100%。

1.2.3.3 形態學觀察 將制備的GFB-PML混懸液用適量純化水稀釋，滴于銅網上，自然晾干，醋酸鈾負染后，進行透射電鏡拍攝，觀察形態。

1.2.3.4 體外釋放度實驗 稱取10 mg GFB-PML凍干粉，記錄質量m2，5 mL釋放介質(PBS7.4磷酸鹽緩沖液，含30%甲醇，V/V)溶解，轉移至透析袋中，置于含95 mL釋放介質的燒杯內，于37 ℃，100 rpm恒溫振蕩器內振搖，平行3組。同時稱取GFB原料藥，甲醇溶解后轉移至透析袋內，相同釋放介質進行釋放。平行3組。分別于第0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h從各燒杯內取樣5 mL,同時補充相同體積的釋放介質，樣品經0.45 μm微孔濾膜濾過后，按“1.2.2.1”項下色譜條件進行濃度檢測，根據下式計算累積釋放率：累積釋放率(%)=(100×Cn+5×∑n-1Cn-1)×10-3/m2×100%，Cn為第n次取樣樣品濃度。以時間為橫坐標，GFB的累積釋放率為縱坐標，繪制釋放曲線。

1.2.4 細胞實驗

1.2.4.1 細胞培養 將A549細胞接種于含完全培養基(含10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM培養基)的培養瓶內，于37 ℃、5%CO2的培養箱內培養，待瓶內細胞數量達80%～90%時可進行傳代。棄去細胞瓶內培養基，生理鹽水清洗后加入1.5 mL胰酶，消化3 min后加入等體積完全培養基終止消化。將細胞轉移至離心管內，800 rpm離心3 min，棄去上清，加入完全培養基吹打均勻后吸取部分轉移至培養瓶內，放回培養箱中培養。

1.2.4.2 細胞攝取 按“1.2.1”項下GFB-PML制備方法，將GFB替換成香豆素-6溶液0.2 mL(0.5 mg·mL-1)制備載香豆素-6的熒光脂質體(C6-PML)。取對數生長期的A549細胞，消化離心后，棄去上層液體，加入新DMEM培養基，計數，以每孔2×104個細胞接種于24孔板，培養箱內培養24 h。吸去培養基后，按C6-PML終濃度為50、200、500、1 000 μg·mL-1將C6-PML培養基溶液加入孔內，培養4 h；吸取500 μg·mL-1C6-PML培養基溶液加入孔內，培養0.5、2、4 h，攝取結束后棄去培養基；生理鹽水清洗3次后，加入500 μL 4%多聚甲醛溶液固定10 min；生理鹽水清洗3次，再加入200 μL赫斯特染料，孵育10 min，繼續清洗3次。于倒置熒光顯微鏡觀察攝取情況并拍照。

1.2.4.3 細胞毒性評價 取對數生長期A549細胞置于96孔板內，密度為每孔1×104個。24 h后棄掉原有培養基，更換為無血清DMEM培養基。按照培養基內PML終濃度為20、50、100、200、300、400、500、1 000 μg·mL-1加入配置好的PML溶液，每個濃度6個復孔，每孔100 μL。加樣后培養箱內繼續培養24 h；24 h后每孔加入50 μL MTT溶液(2 mg·mL-1)，繼續放回培養箱孵育4 h；4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置于平板搖床100 rpm搖動10 min，酶標儀492 nm波長處檢測吸光度值(OD值)。按以下公式計算：細胞存活率(%)=(OD實驗-OD陰性對照)/(OD陽性對照-OD陰性對照)×100%，陽性對照組為不加藥物的含細胞組，陰性對照組為僅加二甲基亞砜的無細胞組。同時，按照培養基內GFB終濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、20 μg·mL-1加入GFB原料藥和GFB-PML，培養24 h后檢測吸光度值并計算細胞存活率。

1.2.5 體內抗腫瘤研究 取2只雌性昆明小鼠腹腔接種小鼠肝癌細胞(H22細胞)懸液，約7 d形成腹水模型。抽取腹水，于離心管內加等量生理鹽水，1 000 rpm離心3 min，棄上清后，生理鹽水分散并計數。細胞濃度調整到每毫升2×107個細胞后，于小鼠腹部右下側皮下接種0.2 mL細胞懸液，待瘤體生長到約800 mm3時開始給藥。32只雌性荷瘤小鼠隨機分為4組，每組8只，分為生理鹽水組，PML組，GFB組，GFB-PML組，尾靜脈給藥，GFB劑量為6 mg·kg-1，每兩天給藥1次共給藥4次，給藥后1 d游標卡尺測量瘤徑(長徑D，短徑d，mm)。按以下公式計算瘤體積V(mm3)=0.5×D×d2，繪制腫瘤體積曲線。給藥結束后解剖瘤塊，稱重，并按公式計算抑瘤率：抑瘤率=(生理鹽水組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重×100%。

2 結果

2.1 GFB-PML的質量研究

2.1.1 GFB標準曲線、精密度、回收率結果 GFB的線性回歸方程為A=72.575C+3.961 5，r=1，表明在0.05～50 μg·mL-1范圍內峰面積與濃度線性良好。低、中、高3個濃度下，測得日內精密度RSD分別為0.45%、0.27%、0.19%(n=5)；日間精密度RSD分別為0.81%、0.84%、1.08%(n=3)，均小于3%，表明該液相方法適合本品測定。低、中、高濃度GFB回收率為101.49%、98.12%、100.88%(n=3)，RSD均小于3%，表明回收率符合要求。

GFB-PML粒徑分布結果及電位測定如下：平均粒徑為(190.00 ± 8.77)nm，PDI值為0.31±0.04，Zeta電位為(-15.07±6.11)mV。載藥量測定結果為5.09%±0.48%，包封率測定結果為99.53%±0.34%。

制備的GFB-PML透射電鏡結果如圖1。透射電鏡觀察可見GFB-PML呈球狀或類球狀，粒徑集中在50～100 nm。

圖1 GFB-PML的透射電鏡圖

2.2 體外模擬釋放結果 以釋放時間為橫坐標，GFB累積釋放百分率為縱坐標，繪制釋放曲線，結果見圖2。其中A代表GFB原料藥組累積釋放率，B代表GFB-PML組中GFB累積釋放率。GFB原料藥組2 h時GFB累計釋放率為59.83%，8 h累積釋放率接近100%，釋放迅速。GFB-PML組2 h時GFB累計釋放率為21.62%，釋放相對于原料藥組較為緩慢，這是由于GFB-PML有較高的包封率，藥物GFB無法迅速透過雙分子層進入釋放介質中；GFB-PML組24 h時GFB累計釋放率接近80%，至48 h仍持續釋放，緩釋效果明顯。

圖2 GFB(A)與GFB-PML(B)體外模擬釋放曲線(n=3)注：與GFB-PML組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 GFB-PML對A549細胞攝取與毒性影響 攝取結果見圖3～4。綠色熒光為細胞攝取C6-PML后顯示的熒光，藍色熒光為細胞核染色后顯示的熒光，紅色熒光為細胞骨架染色后顯示的熒光。綠色熒光越強，表明細胞攝取越多C6-PML。熒光在細胞質內均有分布，圖3顯示，在相同濃度下(500 μg·mL-1)，隨攝取時間增加，綠色熒光強度增強，表明細胞攝取更多C6-PML，細胞對脂質體的攝取呈時間依賴性；圖4顯示，在相同攝取時間下(4 h)，C6-PML濃度越高，綠色熒光強度增強，攝取呈濃度依賴性。由此可以看出，細胞對GFB-PML的攝取呈現出時間和濃度雙重依賴性。

圖3 不同攝取時間下C6-PML在A549細胞內攝取情況(比例尺為20 μm)

圖4 不同濃度C6-PML在A549細胞內攝取情況(比例尺為20 μm)

細胞毒性結果如圖5～6。圖5為PML作用于A549細胞毒性結果，PML在高達1 000 μg·mL-1時對細胞幾乎無毒性，表明PML安全性好，細胞順應性高。圖6為GFB和GFB-PML對A549細胞毒性結果，在低濃度下(0.01 ～ 1 μg·mL-1)，GFB原料藥組對細胞毒性不明顯，說明游離原料藥入胞能力較差，在低濃度時對細胞抑制作用較小；GFB-PML組顯示出較高的細胞殺傷性，細胞存活率顯著低于GFB組(P<0.05)，表明GFB-PML能攜帶GFB入胞，增加了GFB對A549細胞的殺傷性。同時在較高濃度下GFB-PML組細胞存活率低于GFB組(P<0.05)，結合GFB-PML體外釋放結果，可看出GFB-PML能延長GFB在細胞內作用時間，增加細胞對GFB的攝取，進而提高GFB對A549細胞抑制效果。

圖5 PML對A549細胞毒性結果(n=6)

圖6 GFB(A)與GFB-PML(B)對A549細胞毒性結果(n=6)注：兩組間比較，*P<0.05

2.4 GFB-PML對小鼠腫瘤生長的影響 H22荷瘤小鼠腫瘤生長趨勢如圖7，各組小鼠腫瘤體積均隨給藥時間而增長，第0至第2天腫瘤生長較為緩慢。從第4 天開始，生理鹽水組與PML組腫瘤體積增長較快，兩組體積無統計學差異(P>0.05)。GFB組第4、6、8 d與生理鹽水組相比，腫瘤體積大小有所降低，兩組體積無統計學差異(P=0.881、0.443、0.224)。GFB-PML組與生理鹽水組對比，3次測量的腫瘤體積均降低，有統計學差異(P=0.028、0.024、0.009)，對腫瘤生長有較強抑制作用。小鼠處死后解剖瘤體，生理鹽水組瘤重為(6.83 ± 0.87)g，PML組瘤重為(5.85±1.88)g，與生理鹽水組相比，無統計學差異(P=0.973)；GFB組瘤重為(4.28±1.72)g，與生理鹽水組相比，有統計學差異(P=0.016)；GFB-Lip組瘤重為(3.64±2.00)g，與生理鹽水組相比，有統計學差異(P=0.001)。GFB組抑瘤率為37.34%，GFB-PML組抑瘤率為46.71%。可以看出，GFB-PML能增強GFB抑制腫瘤生長的效果。

圖7 H22荷瘤小鼠腫瘤生長曲線(n=8)注：與生理鹽水組對比，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

傳統磷脂、膽固醇通過薄膜分散法制備的脂質體包封率較低，包封率值為50%～80%[13]；本文利用泊洛沙姆407修飾脂質體，包封率明顯提高。相比于泊洛沙姆188，有研究顯示隨泊洛沙姆188含量增加，包封率值沒有顯著性改變[14]，顯示出泊洛沙姆407應用于脂質體載藥時具有提高包封率的優勢。制備的脂質體于4 ℃冰箱放置12 h，沒有出現沉降現象，穩定性較好。

制備的GFB-PML在粒徑測定時由于濃度較大，脂質體之間出現了重疊，而納米粒度測定儀難以分辨，造成測定粒徑結果較透射電鏡觀察結果偏大。體外釋放實驗中，我們選擇磷酸鹽緩沖液作為釋放介質，但由于GFB在中性pH值的磷酸鹽緩沖液中幾乎不溶，所以加入30%(V/V)的甲醇溶液，增加GFB在介質中的溶解度[15]。由于本實驗制備的GFB-PML包封率高，能有效降低突釋現象，發揮緩釋效果。體外細胞攝取實驗從時間和濃度兩方面說明細胞對脂質體的攝取有時間和劑量依賴性。細胞毒性實驗中，相同濃度下GFB-PML比GFB原料藥對A549細胞殺傷性更強，可理解為GFB-PML增加了GFB穿過細胞膜的能力，運載GFB進入細胞內并作用于ATP位點，阻斷信號傳導，從而抑制A549細胞的繁殖、轉移[16]。

有研究以100 mg·kg-1劑量的吉非替尼灌胃方式考察吉非替尼對肝癌H22小鼠的腫瘤作用[17]。本文建立了H22小鼠肝癌腹水腫瘤模型，進行了GFB-PML對肝癌H22小鼠腫瘤生長抑制實驗，以6 mg·kg-1的給藥劑量，尾靜脈注射方式給藥，考察GFB-PML的腫瘤抑制效果。結果可見，制備的GFB-PML對小鼠腫瘤生長有較強的抑制作用，增強了GFB的抗腫瘤效果。同時對比大劑量灌胃方式，低劑量注射給藥也顯現出較顯著的抑瘤效果，為吉非替尼拓展新劑型應用奠定基礎。