長鏈非編碼RNA UC001kfo表達(dá)水平與宮頸癌病人預(yù)后的相關(guān)性研究

田丹，李新，尚學(xué)琴，羅雁

宮頸癌（Cervical Cancer）是常見的婦科惡性腫瘤，高發(fā)年齡原位癌為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，近年來宮頸癌的發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)。宮頸癌的典型表現(xiàn)為接觸性陰道出血，陰道流液，常見病理類型為鱗癌、腺癌和腺鱗癌3種類型，其中以鱗癌（60%～80%）最為常見［1］，目前宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是以手術(shù)、放療和化療為主的綜合治療［2］。盡管隨著宮頸癌疫苗的推廣和各種治療手段的進(jìn)步，近幾年的發(fā)病率和死亡率都有所下降，但是宮頸癌的診斷效率和療效仍有待提高。此外，中國人口眾多，仍有很多的女性病人飽受宮頸癌及治療不良反應(yīng)帶來的痛苦，因此全面深入的研究以提高宮頸癌診斷技術(shù)及治療療效任重而道遠(yuǎn)［3］。

長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）是指轉(zhuǎn)錄長度大于200個(gè)核苷酸，不參與編碼蛋白質(zhì)的一類長鏈RNA。最初人們認(rèn)為LncRNA是基因轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物，并不參與細(xì)胞的其他生物效應(yīng)，但近年來研究顯示LncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4］。研究表明LncRNA在正常組織及腫瘤組織中表達(dá)水平存在明顯差異，LncRNA可分別在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和絨毛癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲［5］，因此，LncRNA與婦科惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA UC001kfo在肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌以及膀胱癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)，提示UC001kfo與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其生理病理功能和作用機(jī)制尚未明確［6-10］。目前國內(nèi)外關(guān)于UC001kfo在宮頸癌中的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究通過比較宮頸癌病人癌組織及癌旁組織UC001kfo的表達(dá)差異，分析UC001kfo與宮頸癌病人臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料收集整理2012年4月2日至2017年2月2日云南省第二人民醫(yī)院收治的81例行手術(shù)切除的宮頸癌病人的宮頸癌、癌旁組織標(biāo)本及其病例資料。所有病人術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸癌，術(shù)前均未行化療、放療以及其他特殊治療，術(shù)后病理再次確診為宮頸癌，病人臨床診療資料完整。所需組織切除離體后立即取材，獲取組織標(biāo)本控制在離體10～30 min，標(biāo)本獲取后置于凍存管并立即保存在液氮中。宮頸癌診斷及其常規(guī)病理資料由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師閱片后確診。術(shù)后分期方法采用國際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）的分期標(biāo)準(zhǔn)。81例宮頸癌病人的年齡范圍為30～61歲，中位年齡為41歲；年齡＜40歲病人為39例，年齡≥40歲為42例；Ⅰ期15例，Ⅱ期22例，Ⅲ期35例，Ⅳ期9例；鱗癌69例，腺癌12例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。69例病人接受了術(shù)后放和（或）化療。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病人或其近親屬簽署知情同意書。

1.2隨訪全部病人術(shù)后出院后均進(jìn)行隨訪，每3～6月隨訪1次，方式為電話、門診或再入院診療時(shí)隨訪，內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀體征、全身體格檢查和影像學(xué)（B超、CT和MRI等）檢查。總生存時(shí)間為手術(shù)后到病人因腫瘤死亡的時(shí)間。腫瘤死亡定義為因腫瘤本身或腫瘤相關(guān)并發(fā)癥導(dǎo)致的臨床死亡。隨訪起始日為術(shù)后病理確診日期，末次隨訪時(shí)間為2018年6月22日，截止隨訪終止病人生存40例，死亡41例，無失訪病例。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）采用qPCR檢測(cè)宮頸癌組織及癌旁組織中UC001kfo的表達(dá)。收集宮頸癌病人癌組織及其癌旁組織標(biāo)本，將勻漿的組織參照Trizol試劑（美國Invitrogen公司）說明書提取總RNA進(jìn)行檢測(cè)。然后參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（中國賽默飛世爾科技公司）說明中的操作步驟及注意事項(xiàng)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qPCR。相關(guān)的引物序列如下：內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的正向引物序列為5′-AATCCCATCACCATCTTC-CAG-3′，反向引物序列為5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；UC001kfo的正向引物序列為 5′-GCCAACGCAAGAAGTTACCA-3′；反向引物序列為5′-CCAAATCATTCCTAGCCAAAG-3′。比較宮頸癌組織與癌旁組織中UC001kfo基因表達(dá)的變化。所有樣品做3個(gè)復(fù)孔。本實(shí)驗(yàn)以計(jì)算2-ΔΔCt值代表UC001kfo相對(duì)表達(dá)量，其中ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對(duì)照=（Ct樣品UC001kfoCt-Ct樣品GAPDH）-（Ct對(duì)照UC001kfo-Ct對(duì)照GAPDH）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入、整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。宮頸癌組織及其癌旁組織中UC001kfo表達(dá)的差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；UC001kfo表達(dá)水平與宮頸癌病人臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。采用Kaplan-Meier法分析各組病人生存時(shí)間，并行Log-rank檢驗(yàn)，Cox回歸模型用于宮頸癌預(yù)后的多因素分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1UC001kfo在宮頸癌組織中表達(dá)及其與病人預(yù)后的關(guān)系qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示81例宮頸癌病人癌組織UC001kfo的表達(dá)（4.694±1.378）明顯高于癌旁組織（1.543±0.598），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.751，P=0.000）。本研究根據(jù)UC001kfo在癌組織及其癌旁組織中表達(dá)水平將全部病人分為UC001kfo高表達(dá)組和低表達(dá)組，高表達(dá)組定義為宮頸癌組織UC001kfo表達(dá)量/癌旁組織表達(dá)量＞2；低表達(dá)組定義為宮頸癌組織UC001kfo表達(dá)量/癌旁組織表達(dá)量≤2［10］，其中高表達(dá)組病人為 50 例，低表達(dá)組為31例。

通過分析UC001kfo表達(dá)與宮頸癌病人年齡、腫瘤大小和病理類型等臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果表明：UC001kfo的表達(dá)與宮頸癌病人的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤局部浸潤深度關(guān)系密切，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 UC001kfo表達(dá)水平與宮頸癌病人臨床病理特征的相關(guān)性/例（%）

2.2UC001kfo表達(dá)對(duì)病人生存期的影響采用Kaplan-Meier法分析UC001kfo表達(dá)與病人生存期關(guān)系，81例宮頸癌病人的中位生存期23.0個(gè)月，總體1、3和5年生存率分別為77.3%、55.1%和48.7%。UC001kfo低表達(dá)組和高表達(dá)組宮頸癌病人的中位生存期分別是49.0個(gè)月和35.0個(gè)月。與UC001kfo低表達(dá)組比較，高表達(dá)組病人的中位生存期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.663，P=0.019），詳見圖1。

圖1 宮頸癌81例中UC001kfo表達(dá)水平與生存期的關(guān)系

Cox回歸多因素分析發(fā)現(xiàn)UC001kfo表達(dá)水平、FIGO臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤深度為影響宮頸癌病人生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，詳見表2。

表2 Cox多因素分析宮頸癌81例臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系

3 討論

從分子生物學(xué)角度更全面深入的研究宮頸癌生存預(yù)后相關(guān)的各種生物標(biāo)志物具有重要臨床意義。有研究發(fā)現(xiàn) lncRNA H19、CRNDE、HOTAIR、MALAT1和MEG3等LncRNA與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和臨床預(yù)后相關(guān)［11-12］。例如，有研究報(bào)道在宮頸癌組織中MALAT1表達(dá)上調(diào)，臨床分析顯示MALAT1高表達(dá)與宮頸癌病人腫瘤大小、臨床分期、血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，是影響宮頸癌病人生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，該研究還發(fā)現(xiàn)HPV可能通過MALAT1促進(jìn)腫瘤生長［13-14］。另有研究報(bào)道HOTAIR在宮頸癌病人癌組織中的高表達(dá)與侵襲性強(qiáng)、預(yù)后不良和放療敏感性等因素有關(guān)［15-16］，lncRNA為包括宮頸癌在內(nèi)的多種婦科惡性腫瘤的診斷和治療提供了新的方向。

潘延鳳等［8，17］利用芯片雜交技術(shù)從肝硬化、肝癌、癌旁及門靜脈轉(zhuǎn)移的肝癌組織中篩選出了lncRNA UC001kfo，其編碼基因位于Chr10（q23.31），共2 043 bp，UC001kfo和細(xì)胞骨架蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）在染色體上存在部分區(qū)域的重疊，ACTA2的啟動(dòng)子在其重疊區(qū)域內(nèi)，UC001kfo與ACTA2存在2段互補(bǔ)序列，并預(yù)測(cè)ACTA2可能是UC001kfo的靶基因，其靶蛋白可能是α-SMA。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)UC001kfo高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的大血管侵犯和TNM分期有關(guān)，UC001kfo高表達(dá)的肝癌病人總生存率和無進(jìn)展生存率明顯降低，單因素和多因素分析均提示TNM分期和UC001kfo高表達(dá)是肝細(xì)胞癌病人預(yù)后不良因素；此外，細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明UC001kfo能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其作用機(jī)制與α-SMA蛋白上調(diào)有關(guān)，該研究認(rèn)為UC001kfo可以作為治療肝細(xì)胞癌的理想靶點(diǎn)［18-21］。

研究發(fā)現(xiàn)UC001kfo與肺腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，UC001kfo在肺腺癌癌組織中高表達(dá)，UC001kfo的高表達(dá)與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，UC001kfo高表達(dá)病人預(yù)后較差，UC001kfo表達(dá)水平是影響肺腺癌病人無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間的獨(dú)立因素（P＜0.05）［7，22］。研究人員通過建立UC001kfo過表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞模型，采用蛋白質(zhì)抗體芯片技術(shù)篩選UC001kfo功能相關(guān)的靶蛋白，結(jié)果表明UC001kfo通過增加BMP-5和SCFR蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展［10］。與以上研究結(jié)論不同，黃秋霞等［9］研究發(fā)現(xiàn)UC001kfo在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，UC001kfo低表達(dá)與高臨床分期呈負(fù)相關(guān)，UC001kfo可能在乳腺癌發(fā)生中起抑癌作用，作者分析其原因可能與不同腫瘤細(xì)胞微環(huán)境誘導(dǎo)的UC001kfo表達(dá)差異有關(guān)。目前l(fā)ncRNA UC001kfo在宮頸癌中的作用尚未明確。本研究結(jié)果提示，與癌旁組織相比，UC001kfo在宮頸癌病人癌組織中呈高表達(dá)，為進(jìn)一步探討UC001kfo的表達(dá)水平與宮頸癌病人臨床預(yù)后的關(guān)系，本研究分析了UC001kfo的表達(dá)與各種臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果表明UC001kfo表達(dá)較高的病人臨床分期晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，局部浸潤明顯，生存期較低表達(dá)者明顯縮短，UC001kfo的表達(dá)水平是影響宮頸癌病人生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，UC001kfo在宮頸癌組織中高表達(dá)，UC001kfo高表達(dá)與宮頸癌病人的預(yù)后不良有關(guān)，UC001kfo為宮頸癌的診斷、治療及其預(yù)后提供了新的研究方向，UC001kfo在宮頸癌中作用及其機(jī)制尚無確切結(jié)論，有待進(jìn)一步研究。