高級別膠質瘤病人放化療前后淋巴細胞亞群變化及意義

張洋洋，高勁，陶振超，何健，楊麗萍，楊婧，周燕，黃一凡

腦膠質瘤是最常見的顱內腫瘤，其中高級別膠質瘤（high grade glioma，HGG）約占腦膠質瘤的77.5%［1］。手術聯合放化療可改善膠質瘤病人預后［2］。但高級別膠質病人的預后相對較差［3］。免疫功能失調是惡性膠質瘤發生、發展的一個重要因素。有研究報道T淋巴細胞亞群與膠質瘤惡性程度相關，術前CD4+/CD8+比值可評估預后［4］。但對于接受術后放化療的腦膠質瘤病人仍缺乏有效的免疫評估指標。本研究通過對51例HGG術后病人同步放化療前后淋巴細胞亞群變化的檢測，探討同步放化療對病人外周血淋巴細胞亞群的影響以及CD4+/CD8+比值對評估HGG病人預后的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2012年6月至2017年7月安徽省腫瘤醫院頭頸放療科收治的HGG術后病人51例，所有納入病人均有影像學和病理診斷證實。同時排除HIV陽性、肝腎功能異常、預計生存期小于或等于3個月、合并嚴重疾病的病人。符合入組標準的病人年齡范圍為10～76歲，中位年齡44歲。其中男性23例，女性28例。年齡≤60歲45例，年齡＞60歲6例。病理Ⅲ級23例，病理Ⅳ級28例。KPS功能狀態評分＞70分38例，KPS評分≤70分13例。腫瘤最大徑≤5 cm 30例，腫瘤最大徑＞5 cm 21例。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2治療情況51例病人均接受基于MRI-CT融合的調強適形放射放療（intensity-modulated radiotherapy，IMRT）。GTV（大體腫瘤靶區）/GTVtb（大體腫瘤瘤床靶區）根據病人術前及術后MRI的T1增強和T2-FLAIR圖像進行勾畫，包括瘤床及殘留腫瘤體積；CTV1為GTV外擴 2～3 cm。CTV2為 GTV外擴1 cm。PGTV/PGTVtb、PTV1、PTV2分別由GTV/GTVtb、CTV1、CTV2均勻外擴3 mm。95%PGTV/PGTVtb：54～66 Gy/27～30 f（2.0～2.2 Gy/f），中 位 劑 量 60Gy；95%PTV1：47.6～54 Gy/27～30 f（1.7～2.0 Gy/f），中位劑量50Gy；95%PTV2：54～60.9Gy/27～30f（2.0～2.1Gy/f），中位劑量56 Gy。同期化療采用替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）（先靈葆雅公司，S016900）口服，劑量為75 mg·m-2·d-1。

1.3外周血淋巴細胞亞群檢測分別抽取51例HGG病人放化療開始前1 d和放化療結束后第1天靜脈血3 mL，靜置1 h后立即送檢。采用美國BD公司流式細胞儀（型號BD FACSCALIBUR）檢測外周血淋巴細胞亞群［CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、自然殺傷細胞（NK）、CD4+CD25+］水平。用流式細胞儀采集淋巴細胞窗內5 000個細胞，Cellquest軟件計算標記陽性細胞百分比。

1.4隨訪及評價標準放化療結束后第1年每3個月，第2～3年每6個月，第4年及以后每12個月復查1次顱腦MRI，評估腫瘤縮退情況。隨訪期間按照RANO標準（Response Assessment in Neuro-Oncology，神經腫瘤反應評價標準）評價療效。采用無進展生存率（progression-free survival，PFS）、總生存率（overall survival，OS）以及中位無進展生存期（median progression-free survival，mPFS）和中位總生存期（median overall survival，mOS）作為觀察指標，從手術當天起算，終點事件為復發和死亡。

1.5統計學方法采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析。觀測資料中的計量資料，以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。生存分析模型為Kaplan-Meier法，兩組生存率比較為Log-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1外周血淋巴細胞亞群水平比較51例HGG病人經同步放化療后外周血CD4+CD25+水平及CD4+/CD8+比值較治療前均有下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。CD3+，CD4+，CD8+及NK細胞水平與放化療前后變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2生存率分析全組中位隨訪時間為14個月，范圍為2～60個月，2例失訪，隨訪率96.1%。mOS為20個月，1、2、3年總生存率分別為71.3%，43.3%，37.2%。mPFS為10個月，1、2、3年無進展生存率分別為51.8%，38.3%，31.9%。

2.3單因素分析CD4+/CD8+比值對生存率的影響

采用Kaplan-Meier模型進行Log-rank檢驗顯示，41例同步放化療前CD4+/CD8+≥1組病人的mPFS及mOS分別為16個月和36個月，10例CD4+/CD8+＜1組mPFS及mOS分別為9個月和11個月，兩組比較均差異有統計學意義（mPFSP=0.004；mOSP=0.031）。見圖1，2。

3 討論

長期以來，中樞神經系統因具有血腦屏障一直被認為是免疫豁免區。但多項研究表明T淋巴細胞可進入中樞神經系統，并同相應的抗原結合，激活免疫應答［5］。Dunn等［6］發現腦血管內皮細胞、星形膠質細胞及血管平滑肌細胞均具有類抗原提呈細胞作用。在病理條件下，T淋巴細胞、NK細胞和巨噬細胞等可突破血腦屏障向腦內浸潤［7］，這些均提示腦膠質瘤的發生、發展與機體免疫功能密切相關。

T淋巴細胞是淋巴細胞亞群中最主要組分，而CD4+/CD8+比值是反映機體免疫功能的重要敏感指標［8］。通常，在機體內CD4+/CD8+比值處于一個相對平衡的狀態，由此保證機體免疫內環境的穩態。當病人免疫功能下降時，其CD4+/CD8+比值將低于正常值。有研究報道手術可提高膠質瘤病人的CD4+/CD8+比值，改善病人免疫功能［9］。Campian等［10］報道放療聯合替莫唑胺可改變膠質母細胞瘤病人外周血單核細胞水平，打破免疫平衡，傾向于免疫抑制。本研究檢測了HGG術后病人外周血淋巴細胞亞群于放化療前后的變化，結果顯示經過同期放化療后CD4+/CD8+比值出現下降趨勢，提示同期放化療可能會抑制T淋巴細胞功能，從而影響病人免疫功能。因此通過評估放化療前后T淋巴細胞亞群變化，對于免疫功能下降的病人，盡早介入營養支持與增強免疫功能治療可能會改善病人預后。

與此同時，本課題組發現CD4+CD25+T淋巴細胞水平經同步放化療后也出現下降。而CD4+CD25+T淋巴細胞是調節性T細胞中最重要的一類，具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特性［11］，能夠促使腫瘤細胞發生免疫耐受和逃逸。EL Andaloussi等［12］首次報道在膠質母細胞瘤組織中CD4+CD25+T細胞浸潤增加的同時，外周血中CD4+CD25+T細胞數目也隨之增加，換而言之，通過檢測外周血CD4+CD25+細胞水平可進一步評估腫瘤組織浸潤情況。

表1高級別膠質瘤病人51例放化療前后淋巴細胞亞群水平比較/（%，±s）

表1高級別膠質瘤病人51例放化療前后淋巴細胞亞群水平比較/（%，±s）

注：NK為自然殺傷細胞

時間放化療前放化療后t值P值CD4+CD25+12.47±3.95 10.22±2.44 4.931 0.000 CD3+63.40±15.19 64.80±15.24-0.618 0.540 CD3+CD4+34.49±7.78 32.19±8.23 1.989 0.052 CD3+CD8+27.97±11.28 30.89±9.82-1.955 0.056 CD4+/CD8+1.39±0.53 1.10±0.31 4.552 0.000 NK 23.08±8.98 23.68±19.36-0.220 0.827

圖2 CD4+/CD8+比值≥1與CD4+/CD8+比值＜1高級別膠質瘤51例總生存曲線比較

結合本組外周血檢測結果，同步放化療在一定程度上降低了膠質瘤病人的CD4+CD25+T細胞水平，降低了免疫抑制作用，防止腫瘤細胞的免疫逃避，對改善預后起著促進作用。但其發生機制可能需要進一步闡明。

影響膠質瘤預后的臨床因素有病理的分級、手術的切除范圍、年齡以及KPS評分等［13-14］。但目前依然缺乏對同步放化療療效的預后評估指標。Shi等［15］研究發現CD4+/CD8+比值與腦膠質瘤惡性程度呈負相關性，CD4+/CD8+比值越低，腫瘤惡性度越高，免疫抑制作用越明顯，機體對腫瘤的抑制能力越差，由此可能會影響病人的預后。鑒于腫瘤發生、發展與機體免疫應答密切相關，本研究進一步探討了同步放化療前外周血CD4+/CD8+比值與預后的相關性。結果顯示CD4+/CD8+比值是影響HGG術后病人PFS和OS的獨立預后因素，CD4+/CD8+≥1的病人預后要優于CD4+/CD8+＜1的病人，這與徐春華等［16］的研究結果基本一致。可見，放化療前CD4+/CD8+比值低的病人，免疫功能低下，術后復發、進展時間相對較早，導致生存時間縮短，影響預后。

此外，研究者發現膠質瘤的發生、發展及復發在很大程度上取決于為數不多的膠質瘤干細胞。這些細胞具有很強的DNA修復、抗凋亡、自我更新及多項分化能力，這使得放化療均不敏感［17］。Yao等［18］發現復發膠質瘤病人膠質瘤干細胞的比例明顯增高，而后者可抑制T細胞增殖，誘導細胞毒性T細胞凋亡，增強了腫瘤細胞的免疫逃避可能。因此，對于那些放化療不敏感或復發的HGG病人，需要我們更加關注機體免疫功能的調節。盡早的有效評估病人免疫功能，及時介入免疫增強治療可能會提高病人的生存期。

綜上所述，同期放化療降低了HGG病人外周血CD4+CD25+細胞水平及CD4+/CD8+比值。CD4+/CD8+比值低的病人，容易出現復發，生存期較短，預后較差。放化療前CD4+/CD8+比值可以作為評價HGG術后病人預后的有效指標。