HIV抗體酶聯免疫試驗結果的影響因素研究

何鳳媛 譚博 趙琳 李貴華

[摘要] 目的 探討抗人免疫缺陷病毒（HIV）酶聯免疫試驗結果的影響因素，提高篩選檢查準確性，為艾滋病的防控工作提供快速準確的科學依據。方法 抽取2017年間送檢至實驗室的患者血清樣本300例，進行回顧性分析，采用酶聯免疫試驗進行初篩選，由市疾控中心對其進行確認，同時對試驗中所用試劑、標本、操作進行詳細分析。結果 在檢測的樣本中，上報20例，確認陽性15例，確認陰性4例，1例為HIV抗體不確定。結論 臨床應嚴格按照試劑盒說明書以及試劑操作要求規范試驗操作，提高酶聯免疫試驗檢測HIV篩選準確率，確保實驗前后質量控制。

[關鍵詞] 酶聯免疫試驗;人類免疫缺陷病毒;影響因素;質量控制

[中圖分類號] R512 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2019）08（a）-0020-03

Study on the Influencing Factors of the Results of HIV Antibody-linked Immunosorbent Assay

HE Feng-yuan， TAN Bo， ZHAO Lin， LI Gui-hua

Chengdu Pidou District Center for Disease Control and Prevention， Chengdu， Sichuan Province， 610000 China

[Abstract] Objective To investigate the influencing factors of anti-human immunodeficiency virus（HIV） enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， improve the accuracy of screening and examination， and provide a fast and accurate scientific basis for the prevention and control of AIDS. Methods A total of 300 patients with serum samples sent to the laboratory during 2017 were selected for retrospective analysis. The initial screening was performed by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， which was confirmed by the Municipal CDC. At the same time， the reagents， specimens and operations used in the test were used and a detailed analysis was implemented. Results Of the samples tested， 20 case were reported， 15 case were positive， 4 case were negative， and 1 case was HIV antibody. Conclusion The clinical practice should be strictly in accordance with the instructions of the kit and the operation requirements of the reagents， and the accuracy of HIV screening should be improved by enzyme-linked immunoassay to ensure the quality control before and after the experiment.

[Key words] Enzyme-linked immunosorbent assay; Human immunodeficiency virus; Influencing factors; Quality control

艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），又名獲得性免疫缺陷綜合征，是由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起。據中國疾控中心、聯合國艾滋病規劃署、世界衛生組織聯合評估，截至2018年底，全人群艾滋病病毒感染率約為9.0/萬，估計新發感染者每年8萬例左右，感染者增加速度沒有減慢，準確并且快速檢測艾滋病十分重要。目前，常用方法初篩方法有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、化學發光或免疫熒光試驗、快速檢測（RT）及其他檢測試驗。其中ELISA試劑盒使用最為廣泛，它具有準確性高、價格低廉、判斷結果又客觀標準、結果便于記錄和保存等優點[1]。但酶聯免疫試驗需大量手工操作，因此易受到多種因素影響，導致結果存在偏差。為了進一步提高酶聯免疫試驗檢測準確性，該文對HIV抗體酶聯免疫試驗結果的常見影響因素進行分析，現報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

抽取2017年間送檢至實驗室的患者血清樣本300例。

1.2? 方法

所有患者均于清晨采取3～5 mL靜脈血，盡量避免溶血，非抗凝血自然凝固1～2 h后，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，制備標準，監測24 h。將酶復合物用稀釋液稀釋后，加血清及陰性、陽性對照。經過1 h的孵育，然后洗板，加底物，30 min避光反應后加終止液即完成反應部分。使用北京萬泰試劑以及深圳愛康全自動酶免儀，在實施檢測過程中，根據試劑使用說明書以及儀器操作指導進行操作，提高質量管控力度。當檢測結果顯示陰性，則出具詳細陰性報告;當顯示陽性，則應將檢測結果送至市疾控中心艾滋病確認實驗室進行確認，整個過程做好保密工作。之后讀數，由數值來判斷結果的陰性或陽性。

2? 結果

全自動酶免儀設為2個陰性對照孔，平均OD值不超過0.1，同時2個陽性對照孔OD值不小于0.8，陽性對照孔OD值與臨界值相差0.12，當實驗檢測吸光度不在陰陽限定范圍內時，即可對相關原因進行判定，重新檢測予以確認。在檢測的樣本中，上報20例，確認陽性15例，4例確認為試驗陰性，1例為HIV抗體不確定。

3? 討論

酶聯免疫試驗特異性強，靈敏度高，重復性好，但檢測結果易受多種因素影響，優質試劑、標準化儀器、規范操作方法、高素質技術人員均是保障試驗順利進行的不可缺少的條件。其中任何一項均可能導致檢測結果假陰性或者假陽性的出現，影響后續工作。因此，臨床應加強管控HIV抗體初篩查質量，確保結果準確性。經大量臨床實踐分析[2]，現將影響因素歸結為下幾方面。

3.1? 試劑因素

3.1.1 試劑的選擇? 檢測結果質量是建立在優質HIV抗體試劑基礎上的。選擇優質試劑考慮因素眾多，例如靈敏度、特異性、緊密度、安全性、簡單性等，做出全面客觀評估，結合實驗室具體情況選擇靈敏度高、特異性強試劑。實驗室應通過廠家詳細了解試劑包被物組成成分，包括原料來源、片段組成、片段長短等多項內容[3]，進而判斷抗原、抗體包被完整性與特異性，查看試劑批號具體了解試劑質量水平與優劣，客觀、合理選擇實驗室試劑。注意訂購長效批號試劑，以免發生批號改變時重建質量管控體系。

3.1.2 試劑的準備? 在臨床實驗中常常忽略了試劑的準備程序，將試劑從冰箱中拿出來便立即使用，而該做法可能影響后續工作步驟時間，這可能導致弱陽性標本出現假陰性結果[4]。實驗前因將試劑從2～8℃冰箱取出后放置室溫約20～30 min，待試劑盒與室溫平衡后再進行檢測，使反應微孔中溫度滿足檢測所需，避免試劑溫度引起的結果偏差。

3.2? 樣本因素

①當樣本存在嚴重溶血或混有紅細胞血清時，極易附著在聚乙烯孔內，清洗困難，未清洗干凈的血紅蛋白具有過氧化物酶活性，作用于催化底物造成假陽性，因此，實驗室應嚴格禁止使用嚴重溶血標本。

②受污染標本中可能含有內源性辣根過氧化物酶，可能導致實驗出現特異性顯色。因此，酶聯免疫試驗應采集新鮮標本。如果未能立即進行實驗，在5 d之內將試劑放置于4℃保存，若安排1周后檢測應在低溫下凍存[5]。在收集標本試劑時堅持使用無菌試管，有效防止污染試管。長期未使用試劑反復放置于冰凍保存中，其過程中存生機械剪切力對于蛋白質分子具有破壞力，造成檢測結果假陰性。因此，酶聯免疫試驗應盡量采用新鮮標本，避免長時間反復融凍樣本。

③標本凝固不全。正常情況下，采集血液于30 min～2 h開始凝固，在18～24 h開始完全收縮。有時為了爭取實驗時間，在血液未凝固時便開始進行離心處理，血清中仍殘留部分纖維蛋白原。在實驗過程中形成明顯纖維蛋白塊，附著于酶物標孔壁內，不易清洗，導致檢測結果假陽性或假陰性。因此，應充分凝固血液標本后再進行分離處理。或者使用帶分離膠的采血管采集標本，也可以在采血管中加入適當促凝劑。

3.3? 控制方法

①加樣。規范加樣操作，垂直滴加試劑，禁止出現傾斜、人為加大試劑量。加樣吸嘴工具是否干凈以及吸取試劑量多少對檢測結果準確性具有直接影響。吸嘴構造特殊，清洗困難，極易發生交叉污染。推薦使用一次性吸嘴[6]。定期清洗加樣器并做好校準工作。每人均具有1個移液頭，以免出現交叉污染。標本加于微孔底部，不可濺出，不可產生氣泡。

②溫育。96孔酶標板結構特殊，易發生邊緣效應。經研究證明抗原抗體結合、酶促反應對于溫度均具有較高敏感性。酶際板周圍以內部孔升溫、降溫度速率方面存在差異[7]，進而導致周邊與內部孔顯示結果不同。酶聯免疫吸附試驗最佳條件為水浴，溫浴時間應準確按照定力要求，嚴格控制溫箱溫度，盡量保持溫育過程，避免發生邊緣效應[8]。

③洗板。洗滌在酶聯免疫吸附試驗中具有重要作用，手洗條件較差，加大誤差出現率，半自動或者全自動洗板機，當未規范操作時，也會出現結果誤差。殘留纖維蛋白絲、洗滌液中析出結晶體均可能不同程度堵塞洗板機針小孔，未能完全洗脫，出現“花板”，造成檢測結果假陽性或者假陰性[9]。因此，應注重矯正洗板機洗板時注射量以及殘液量，在結束后使用蒸餾水進行清洗。將蒸餾水注滿每個反應孔，確保殘液量小于2 μL，拍干。為了進一步提高洗滌效果，在實驗過程中，可以將機器洗滌與人工洗滌相結合，首先進行機洗，再進行1～2次人工洗板，也可以根據實際情況合理增加洗地板數量。

3.4? 顯色

在終止顯色中應嚴格規范操作程序，在顯色終止15分鐘內讀取酶標儀顯示數據，注意禁止將酶標儀放置于陽光或者強光照射下，在進行預熱15～30 min后再開始進行操作。顯色淺情況下，肉眼難以觀察，影響檢測結果準確性。

3.5? 質控

每批測試結果可以通過試劑盒陰陽性對照，室內質控品質控，同時做好質控圖，以便于判斷檢測結果是否準確可靠，對于異常結果應重復實驗或換廠家試劑盒對樣品進行復查，并及時與臨床主治醫師溝通交流。

綜上所述，HIV抗體酶聯免疫試驗操作簡單，但影響結果因素具有多樣化，導致結果出現假陰性或者假陽性。因此，在實驗過程中要求加強質量管控工作，要求檢驗人員嚴格遵守試劑盒說明書和檢測技術規范，盡可能避免或者減少影響因素的發生，提高檢測結果準確性，為艾滋病的防控工作提供快速準確的科學依據。

[參考文獻]

[1]? 李金明.臨床酶免檢測技術[M].北京：人民軍醫出版社，2006：11.

[2]? 崔海燕，薛秀娟，劉春華，等.HIV抗體確證試驗不確定結果的解析[J].中國艾滋病性病，2017，12（7）：596-598.

[3]? 徐俊，郭楠，劉敏.酶聯免疫法篩查HIV抗體在艾滋病診斷中的應用價值[J].國際病毒學雜志，2016，23（1）：53-56.

[4]? 楊芬蘭，穆廷杰，陳濤.抗-HIV抗體篩查與免疫印跡試驗兩種檢測方法的對比研究[J].國際檢驗醫學雜志，2017，38（7）：948-950.

[5]? 許衛萍.探討乙肝五項酶聯免疫吸附法檢測結果常見影響因素分析[J].中外健康文摘，2014，5（2）：155-156.

[6]? 查文云.酶聯免疫吸附試驗中常見影響因素及控制方法[J].世界最新醫學信息文摘，2015，14（29）：115.

[7]? 張春艷.酶聯免疫吸附試驗檢測結果的影響因素和應對措施[J].中國醫藥指南，2014，8（29）：393-394.

[8]? 何莉，孫海，胡松，等.雙抗夾心法酶聯免疫吸附試驗影響因素探析[J].檢驗醫學與臨床，2016，13（7）：873-875.

[9]? 楊琪.對酶聯免疫吸附試驗結果OD值影響的因素分析[J].醫學美學美容旬刊，2015，24（6）：221.