細菌種間相互作用及其對混合感染的影響

錢鎏佳 吳佳慧 陳代杰,2,*

(1 中國醫藥工業研究總院 上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 201203；2 上海交通大學藥學院，上海 200240)

混合感染是指由兩種或多種病毒、細菌、真菌或寄生蟲等組合引起的急性或慢性疾病。本綜述中主要探討不同物種的細菌組合引起的感染。通常來說，一種細菌的存在將為其他致病菌創造一個繁殖的生態位；并且宿主易于被其他微生物定植，或導致多種非病原微生物共存從而引起疾病[1]。相較于單一微生物感染，混合感染通常與感染嚴重程度的增加和患者預后較差有關[2-3]。其機制可能是多物種微生物間通過化學物質或直接物理接觸發生種間交流，從而產生協同作用以誘導毒力因子表達，競爭常駐微生物生態位以及調節宿主免疫應答等。本綜述中，我們總結了細菌間相互作用的方式及其對混合感染的影響(表1)，旨在深入探索混合感染病理進程，為混合感染的干預治療提供策略，拓寬抗菌藥物發展思路。

1 混合感染在臨床上的重要性

在早期感染研究過程中，人們受到科赫法則的影響，普遍認為病原菌是指能從病灶分離后在實驗室獲得純培養，并可以再次感染健康人體及重新分離培養的微生物。這一法則對理解許多感染疾病的病原學具有非凡的意義，但它也有一定的限制。因為根據這些法則更容易分離出病灶中占主要的微生物物種，而忽視了疾病早期階段其他微生物對病程的貢獻[21]。雖然目前常將單一微生物感染作為微生物感染發病機制的研究重點，然而隨著測序技術和群體分析方法的出現[22]，我們發現很多感染都表現為多種微生物感染，同時人體原駐微生物群與感染病原體間的相互作用也會影響病程。

在多微生物感染中，一種微生物為另一種微生物產生了利于感染及定植的生態位；此外，兩種或多種非致病性微生物的共同感染會導致菌血癥等嚴重感染。在肺部囊性纖維化，泌尿道感染[23]，肺炎，醫療設備相關感染，中耳炎[24]，牙周炎，炎癥性腸感染，傷口感染及糖尿病潰瘍等與體外接近的體位或易發展菌膜的感染中，混合感染較為常見并且通常影響病理進程。比如囊性纖維化肺中常見銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、嗜血菌、流感嗜血菌、洋蔥伯克霍爾德菌等細菌引起的混合感染。這些細菌通過代謝飼喂或群體感應相關信號等機制增加抗菌耐受性和生物膜發展[25-28]。在牙周炎中常見牙齦卟啉單胞菌，密螺旋體，非典型韋榮菌，具核梭桿菌及伴放線桿菌等引起的混合感染。這些細菌通常通過代謝產物交換，共聚及種間信號促進菌膜形成，提高細菌持留性并促進慢性炎癥[29-31]。傷口感染及糖尿病潰瘍中常見金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，腸球菌，脆弱擬桿菌，棒狀桿菌屬細菌的混合感染。這些細菌通常通過形成菌膜，肽聚糖感應及調節宿主免疫防御等方式延遲傷口愈合并提高抗生素耐藥性[32-33]。因此，混合感染常延長感染病程，增加治愈難度及治療費用。

表1 細菌種間相互作用的方式以及其對病程的影響Tab.1 Bacterial interspecific interactions and their influences on mixed infection

另外，腸道菌群可以減緩病原菌在腸道中的定植與過度增殖，進而利于感染的預防與治療[34]。這種相互作用通常是間接的，包括調節免疫系統，增強腸上皮細胞障礙，或與病原體營養素的競爭等。而最近一些研究發現腸道菌群可以通過分泌物直接與病原菌相互作用。例如，Sassone-Corsi等[35]通過小鼠實驗證明腸道益生菌大腸埃希菌Nissle 1917(EcN)分泌的小菌素可以限制病原腸桿菌的增殖，包括共生大腸埃希菌，黏附侵入性大腸埃希菌和相關病原體腸沙門菌，這表明了益生菌分泌的小菌素可以通過種間和種內競爭來減少病原菌的定植。Piewngam等[36]通過對健康個體糞便樣本的分析及小鼠感染模型的驗證，發現腸道中芽孢桿菌可以介導金黃色葡萄球菌的清除并發現芽孢桿菌分泌的芬芥素脂肽作為群體感應阻斷劑實現對腸道金黃色葡萄球菌的根除。

2 細菌種間相互作用

2.1 信號分子

細菌產生多種可擴散分子并以不同的信號感知和傳導方式影響周圍的細菌。同一物種的細菌群體內通常通過信號分子來監測環境并相應地調整行為，而這些群體感應信號分子對細菌種間相互作用也產生影響。這種信號分子包括自誘導分子-2(AI-2)，擴散性信號分子(DSF)家族，N-酰基高絲氨酸內酯(AHLs)，假單胞菌喹諾酮信號(PQS)等[37-38]。

2.1.1 自誘導分子-2(AI-2)

自誘導劑-2(AI-2)是LuxS酶的產物，它在各類細菌種廣泛存在。LuxS酶合成4,5-二羥基-2,3-戊二酮(DPD)，經過自發重排[39]形成DPD衍生物，這些分子通常稱為AI-2[40]。不同細菌識別不同的DPD衍生物，而衍生物通過自發重排而互相轉換與均衡，這一性質使得細菌既可以響應自身產生的AI-2，也可以響應其他物種細菌產生的AI-2。這表明AI-2是細菌種間通訊的通用語言。

在混合感染中，AI-2影響了生物膜的形成和各種毒力因子的產生[41]。Perez等[4]通過體外生物膜測定及小鼠感染模型對中耳炎相關細菌的研究揭示了luxS缺陷卡他莫拉菌與生產AI-2的肺炎鏈球菌之間的協同作用。在小鼠混合感染模型中，肺炎鏈球菌合成的AI-2增加黏膜炎莫拉菌在鼻咽部的定植，但并不影響體外混合生物膜形成，這也強調了研究需要從動物實驗研究和體外實驗兩個層面來共同探究細菌種間相互作用的結果。Armbruster等[5]也發現流感嗜血菌合成的AI-2能夠促進混合生物膜形成及黏膜炎莫拉菌對毛絲鼠感染過程中的持留性發展。Duan等[6]通過囊性纖維化患者痰液中分離的無毒金黃色葡萄球菌和鏈球菌與銅綠假單胞菌共感染大鼠肺部，發現這兩種菌可以提高銅綠假單胞菌對肺的損傷作用。AI-2可以由囊性纖維化患者痰液中的金黃色葡萄球菌和鏈球菌產生，而不能由銅綠假單胞菌產生。而且體外研究發現，囊性纖維化(CF)肺患者產生的痰液中的AI-2濃度也足以調節銅綠假單胞菌毒力因子啟動子的轉錄，進一步說明了種間AI-2信號確實促進了囊性纖維化(CF)肺的病理進程。

2.1.2 擴散性信號分子DSF

擴散性信號分子DSF在野油菜致病型單胞菌中發現，其信號傳導有助于一系列細菌功能，包括毒力、生物膜形成、運動、與昆蟲相互作用及抗生素耐受性等。DSF的結構為順式-11-甲基十二碳烯酸[42]，其中2位的順式不飽和雙鍵是活性關鍵結構，同時甲基分支及脂肪酸鏈長都會影響其活性。DSF合成完全依賴于RpfF(與烯酰基CoA水合酶同源)并部分依賴于RpfB(長鏈脂酰CoA連接酶)。傳感因子RpfC和調節因子RpfG組成的雙組分信號轉換系統與DSF感應和信號傳導有關，它控制胞外酶和多糖毒力因子的合成[43]。目前這種信號分子已經在嗜麥芽寡養單胞菌、伯克霍爾德菌及銅綠假單胞菌等中發現。

Ryan等[7]發現在混合物種生物膜中，嗜麥芽寡養單胞菌通過合成的可擴散信號因子(DSF，順式-11-甲基-2-癸烯酸)顯著影響銅綠假單胞菌的形態，使其發展為細絲狀，同時這一作用也可以通過添加合成的DSF來模擬。已知銅綠假單胞菌主要由一種傳感器激酶PA1396來感應DSF，因此研究人員通過比較PA1396突變株及外源性DSF培養細菌的蛋白質組學分析發現PA1396的突變或外源性DSF會導致銅綠假單胞菌許多毒力或脅迫耐受性有關蛋白質的相對豐度增加，其中包括陽離子抗微生物肽耐藥性相關的蛋白質。通過進一步的驗證性實驗發現，銅綠假單胞菌通過響應DSF改變了生物膜形成能力和多黏菌素耐受性。Deng等[8]通過RT-PCR等手段發現，洋蔥伯克霍爾德菌產生的順式-2-十二碳烯酸(BDSF)通過干擾銅綠假單胞菌的群體感應(QS)系統和III型分泌系統(T3SS)來介導和銅綠假單胞菌之間的通信交流，從而導致銅綠假單胞菌的生物膜形成和毒力因子合成的下調。此外，研究者進一步發現外源性BDSF將顯著降低HeLa細胞和斑馬魚感染模型中銅綠假單胞菌的毒力。Twomey等[9]在感染嗜麥芽寡養單胞菌和伯克霍爾德菌的CF患者痰液中發現生理濃度的DSF和BDSF，通過培養依賴性分析認為這兩個信號的存在與嗜麥芽寡養單胞菌和伯克霍爾德菌的定植相關。此外，在CF肺小鼠模型中發現外源DSF增加了銅綠假單胞菌的持留性，這進一步證明了種間DSF介導的細菌相互作用在CF肺部感染期間存在并可能發揮一定作用。

2.1.3 其他

在細菌信號分子中，吲哚分子由于其多樣的生物學作用而備受關注。研究發現，超過85種革蘭陽性和革蘭陰性菌，包括許多致病菌如芽孢桿菌，致病性大腸埃希菌，幾種志賀菌菌株，糞腸球菌和屎腸球菌等都可以產生吲哚。這些細菌產生的吲哚可以調節一些不產生吲哚分子的病原體的毒力[44]。Chu等[10]研究發現環一磷酸腺苷(cAMP)調節的吲哚形成是使大腸埃希菌在混合生物膜和具有銅綠假單胞菌的浮游群體中生長的主要因素。通過特定突變體的轉錄分析和混合感染菌株之間的競爭性研究發現，cAMP調節的吲哚主要通過淬滅銅綠假單胞菌中N-酰基-高絲氨酸內酯(AHL)調節的銅綠假單胞菌的產生而促進混合培養中的大腸埃希菌生長，這說明吲哚可以通過干擾AHL群體感應來抑制銅綠假單胞菌的毒力。Lee等[11]通過轉錄分析發現，多種腸道微生物產生的胞外吲哚及其衍生物7-芐氧基吲哚通過抑制金黃色葡萄球菌毒力基因如α-溶血素hla，腸毒素seb和蛋白酶基因splA和sspA等的表達從而降低細菌感染時的毒力。這一發現反映了吲哚衍生物是有潛力的抗持留性金葡菌感染的候選化合物。

另外，革蘭陽性菌脫落的肽聚糖、細菌發酵過程中產生的過氧化氫、琥珀酸以及金黃色葡萄球菌產生的α毒素也在種間相互作用中發揮效應[45]。Korgaonkar等[12]通過果蠅和小鼠感染模型探究發現，銅綠假單胞菌利用雙組分系統受體感知并響應革蘭陽性細菌脫落的肽聚糖以刺激多種細胞外因子，而這些細胞外因子具有對原核和真核細胞的溶解活性。因此，這種種間相互作用不僅使得銅綠假單胞菌改變了群體組成，也同時加強了對宿主的毒力。這一結果提示靶向革蘭陽性細菌的治療策略可能是降低復合感染嚴重程度的可行方法之一。Ramsey等[13]發現鏈球菌糖類發酵過程代謝物過氧化氫能夠通過氧化應激反應調節因子OxyR介導來誘導牙周炎病原體伴放線聚生桿菌中補體抗性蛋白基因apiA的轉錄，進而增強了伴放線聚生桿菌對血清補體殺傷作用的耐受性，這表明在共培養期間牙周炎病原體對宿主先天免疫的抵抗力增強。Wang等[46]將痤瘡患者鼻部皮膚微生物與痤瘡丙酸桿菌共同培養后發現痤瘡丙酸桿菌生長被抑制，通過菌株鑒定后確認是表皮葡萄球菌抑制了痤瘡丙酸桿菌。結果表明，表皮葡萄球菌通過厭氧發酵甘油產生琥珀酸，降低環境pH，從而控制痤瘡丙酸桿菌的過度生長。

2.2 代謝交叉飼喂

在群體中，不同細菌的代謝能力是互補的。因此，不同物種的細菌也可以通過代謝物交叉飼喂進行合作，即其中一個物種能夠利用另一物種代謝途徑的終產物。營養合作在口腔細菌中尤為明顯，這種合作可以在共同降解牙菌斑唾液黏蛋白MUC5B的5種細菌中發現[14,47]。同時這種代謝物交流也可以產生互惠效果，比如在由非典型韋榮菌和格氏鏈球菌形成的混合菌膜中，非典型韋榮菌可以利用格氏鏈球菌產生的乳酸，而格氏鏈球菌能夠對非典型韋榮菌產生的可擴散分子做出響應從而產生淀粉酶[15]。與此同時，交叉喂養也使一些細菌在面臨碳源選擇時優先消耗周邊細菌的發酵產物，而這種碳源的選擇可能會影響細菌的生長和毒力水平。例如，機會致病菌銅綠假單胞菌通過利用CF氣道中常駐細菌的發酵產物比如2,3-丁二醇代替葡萄糖而表現出改變的毒力表型[16]。

Ramsey等[29]通過伴放線聚生桿菌和共生菌格氏鏈球菌的多微生物小鼠膿腫感染模型研究發現與格氏鏈球菌的共培養能夠增強伴放線聚生桿菌的體內持留性，這種協同相互作用需要伴放線聚生桿菌利用格氏鏈球菌產生的主要代謝產物L-乳酸作為碳源。這種交叉飼喂通過與快速生長的常駐鏈球菌的前期營養競爭，進而允許伴放線聚生桿菌的持留及后期感染。Kuboniwa等[48]通過鼠口腔感染模型研究發現鏈球菌產生的4-氨基苯甲酸/對氨基苯甲酸(pABA)是牙周炎關鍵病原體牙齦卟啉單胞菌和共生病原體格氏鏈球菌之間的協同促進病原體體外形成群落及體內的持留所必需的。代謝組學和蛋白質組學數據顯示，外源pABA用于葉酸生物合成，并提高菌毛黏附素表達。然而，pABA也導致牙齦卟啉單胞菌體內毒力降低并抑制其產生細胞外多糖，說明定植和致病性在功能上是不同的。在感染過程中細菌必須克服多種宿主的抵御，包括營養性鐵元素的限制，才能在宿主體內持留并導致疾病。Keogh等[49]發現在宿主混合物種感染時鐵元素可用性受限的條件下，糞腸球菌可以通過釋放L-鳥氨酸增加大腸埃希菌生物膜的生長和存活率，因為這種代謝的改變有利于大腸埃希菌鐵載體耶爾森桿菌素的生物合成，允許大腸埃希菌菌膜在限鐵條件下生長。這種現象在體外和小鼠感染模型中都得到了驗證。

2.3 物理相互作用

2.3.1 黏附素相關結構

細菌通過物理接觸進行種間交流方式的理解很多來源于對生物膜形成的研究。通過體內和體外模型對慢性臨床感染的研究能夠發現混合物種細菌生物膜對慢性感染如中耳炎，傷口感染和CF肺部感染等的影響。在混合物種生物膜中物種間的協同相互作用通常會增加生物膜生物量和增強抗生素耐受性[4,50]。這些物理相互作用通常是由一種細菌通過菌毛、鞭毛等黏附素結構結合另一細菌的互補受體實現的。

Cope等[51]通過RT-qPCR比較肺炎鏈球菌及流感嗜血菌兩種細菌單培養和混合培養生物膜中關鍵毒力因子的基因表達發現，僅在體外共培養時流感嗜血菌表達IV型菌毛，并在離體慢性鼻竇炎患者組織中也得到了驗證。在囊性纖維化患者體內通常發生金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌的共感染，并且與更高的發病率和死亡率相關。金黃色葡萄球菌分泌許多與宿主組織相互作用的物質，影響炎癥反應。Armbruster等[17]發現分泌物葡萄球菌蛋白ASpA抑制特定銅綠假單胞菌臨床分離株的生物膜形成及中性粒細胞對所有測試的臨床分離株的吞噬作用。這兩種作用是通過SpA與細胞表面結構IV型菌毛和外多糖Psl結合而介導的，這兩類細胞表面結構與菌膜形成相關，同時由于SpA的結合避免了IgG介導的吞噬作用。對腸道病原體的研究表明感染細菌的共聚集也可以促進對真核細胞的依從和入侵。Alex等[18]發現，與單一感染相比，腸聚集性大腸埃希菌和宿主共生腸道菌弗氏檸檬酸桿菌對HeLa細胞共感染時黏附力顯著增加。通過細菌沉降測定發現攜帶F-菌毛基因(traA)的腸聚集性大腸埃希菌僅在弗氏檸檬酸桿菌存在下才能形成細菌聚集體，同時掃描電子顯微鏡分析顯示，細菌聚集體以及共感染形成的增強的生物膜均由柔性菌毛介導。此外，使用F菌毛的特異性抑制劑顯著降低了混合感染菌膜的形成。這進一步說明了混合生物膜形成過程中的這種協同作用由細菌間的菌毛介導。

2.3.2 其他物理相互作用

細菌細胞之間其他的幾種物理相互作用機制也在感染過程中發揮作用。其中，VI型分泌系統(T6SS)介導許多革蘭陰性細菌物種之間的相互作用。T6SS是由13個保守蛋白和不同的輔助元素組成的復雜結構，其廣泛分布在動物和植物的病原體和共生體中[52-53]。T6SS最初是在霍亂弧菌和銅綠假單胞菌中鑒定出來的，它通過直接靶向真核細胞來實現毒力[54-55]。隨后發現大多數T6SS也通過直接將毒素輸入競爭細菌細胞內來調節細菌間競爭，攻擊細菌由于具有同源免疫蛋白而免受侵害[56-57]。為了建立感染，病原體必須克服天然微生物建立的定植屏障。比如腸道病原體利用T6SS選擇性靶向共生變形菌，以占據相對有利的生態位。穩定定植后，T6SS進一步幫助病原體抵御其他入侵競爭對手。研究發現腸道機會致病菌黏質沙雷菌能夠表達并分泌T6SS至培養基中發揮抗菌活性。在與另一機會致病菌陰溝腸桿菌混合培養時發現，T6SS是黏質沙雷菌產生持留所必需的[19]。另外，來自囊性纖維化患者的銅綠假單胞菌臨床分離株具有高抗菌活性的T6SS，同時患者肺分泌物和血清中也發現相應的特異性抗體[20]。

3 對抗菌策略的啟發

在混合感染中，豐富的宏基因組學和遺傳學數據對于臨床感染診斷和治療都是非常直觀且重要的。目前對于混合感染的首選治療策略仍然是使用廣譜抗生素[58-59]。然而，這類抗生素在很多案例中都無效或治療失敗。多種耐藥菌株的出現和流行使這一問題更加復雜。通過對混合感染的廣泛而深入的理解和研究，讓我們發現了微生物間的化學和物理相互作用確實影響了病原體的毒力及感染病程的發展。對病原體間化學及物理相互作用進行調節，從病原體信號系統及黏附素等途徑中尋找替代性治療方法，這或許可以為治療混合感染患者開發新型及個性化治療方案提供方向。

3.1 干擾細胞間的交流

群體感應(QS)通過基因調控手段基于細胞密度來調節細菌生理活動。通常，QS信號通過協同產生毒力因子如毒素，蛋白酶和其他免疫逃避因子來直接促成發病機制。另外，QS有助于細菌對抗生素產生耐受與耐藥，如生物膜發展[60]。如上所述的信號分子很多都屬于QS通信系統[61]，因此，開發抑制感染細菌間的QS通信系統的化合物策略對于影響感染發病機制和提高細菌對抗生素敏感性是可行的。

雖然QS信號系統的種類繁多，但信號供應和響應的關鍵步驟是保守的[62]，因此QS抑制劑(QSI)主要分為兩類：信號供應抑制劑和信號響應抑制劑。目前已有大量研究從植物提取物[63]，海洋生物提取物[64]等資源中通過生物傳感器菌株及色譜法篩選QSI。Chang等[65]通過構建異源表達銅綠假單胞菌AHL合成酶LasI和RhlI的大腸埃希菌，使用AHL生物傳感器和高分辨率液相-質譜(LCMS)手段評估其AHL產量來篩選AHL合成酶抑制劑。其中篩選獲得的3種最強的抑制劑為水楊酸，單寧酸和反式肉桂醛。LC-MS分析進一步有效地證實了單寧酸和反式-甲醛通過RhlI抑制AHL產生，其中反式-甲醛抑制銅綠假單胞菌中的綠膿菌素產量高達42.06%。分子對接分析表明，反式-甲醛與LasI和EsaI底物結合位點相互作用。

目前對于QSI對感染病程及細菌敏感性的影響仍受篩選模型影響，因為常用的富營養培養基無法模擬自然感染條件[66]。同時也有研究發現QS阻斷可能會增加醫院感染毒力[67]。但是QSI的研究與開發確實也為混合感染有效治療方案的開發提供了動力，同時也需要進一步深入研究機制以及開發合適的篩選模型。

3.2 破壞細菌間物理接觸及吸附作用

菌毛是細菌菌膜形成和附著于宿主細胞或其他細菌所需的黏附性表面結構，該結構的缺失通常導致細菌毒力的急劇下降。對菌毛結構的化學靶向已經被認為是中和各種感染的一種方法。對靶向致膿性大腸埃希菌I型菌毛靶研究發現，通過模擬正常菌毛蛋白亞基結構干擾菌毛生產，導致細胞聚集減少并提高各種體內模型中感染的清除率[68-69]。雖然在混合細菌感染治療過程中這種模擬正常菌毛蛋白亞基結構還沒有被驗證，但是在幾種可能攜帶共生菌的小鼠的研究中顯示有效證明了這種方法的潛力。另外，合成肽和模仿菌毛黏附素片段的甘油磷酸酯衍生物在幾種小鼠口腔感染治療中是有效的[70]。然而這些分子目前還存在具有較強的細胞毒性等缺陷，而且它們對抗混合感染的效果還需要更合適的體內模型來檢驗。Virstatin也被證明通過干擾細菌IV型菌毛的形成而抑制鮑曼不動桿菌生物膜形成[71]。但研究者還發現其抑制菌毛作用具有菌株特異性，可能通過促進其他類型菌毛來提高吸附作用。雙環2-吡啶酮家族的菌毛抑制劑對腸桿菌科I型菌毛有抑制活性，同時也對尿路病原菌的菌毛顯示抑制作用[72]。

4 展望

對于細菌混合感染越來越深入的研究，讓我們更深入地了解細菌種間相互作用在細菌敏感性和感染病程嚴重性等方面的的影響。盡管目前已有較多證據顯示，細菌種間相互作用影響細菌混合感染病程，通過探索破壞細菌間化學信號交流或物理接觸吸附作用的策略能夠協同或產生抗菌作用，幫助感染治療。但細菌間化學信號及物理接觸相互作用是復雜的并受到多種因素影響，與細菌種屬，病灶部位，原駐微生物群等相關。因此，對混合感染和細菌種間相互作用間的研究還需結合具體情況進行研究分析，才能提供更多、更準確的信息來對抗混合感染，優化臨床治療策略并拓寬抗菌藥物研發思路。