鼠李糖乳桿菌對頭孢曲松引起的幼年期腸道菌群及生長發育異常的改善效果研究

郭佳汶 程如越 張瑜杰 周瑋忻 王柯 陳書巧 彭天宇 李鳴 何方

(四川大學華西公共衛生學院營養與食品衛生學及毒理學系，成都 610041)

人體腸道棲息著數量龐大，種類繁多的微生物，其與人體高度共生，構成了復雜的腸道微生態系統。腸道菌群的穩態與人體健康息息相關。近年來，由于抗生素的預防和治療作用，兒童抗生素暴露率越來越高，抗生素在殺滅病原菌的同時也會部分殺滅一些腸道共生有益菌，從而導致腸道菌群的紊亂。大量研究提示了腸道菌群紊亂與疾病之間有著密切的關系。潰瘍性結腸炎是一種慢性結腸炎癥，腸道菌群紊亂被認為是影響其進展的重要因素[1]。傅玲琳等[2]從分子及細胞水平出發，闡述了腸道微生物與食物過敏之間的聯系。近年來，兒童哮喘發病率增高也普遍認為與腸道菌群失衡有關[3]。本課題組的前期研究也表明頭孢曲松可以引起初生小鼠的腸道菌群紊亂，導致受試小鼠的腸道組織發育缺損[4]，影響受試小鼠的免疫系統發育，從而引起小鼠成年后表現出對食物蛋白的易感性。因此，研究改善人類生命早期的腸道菌群失調的方法將成為重要趨勢。

益生菌是指能改善腸道微生物平衡，當攝入足夠數量時，對宿主有積極的健康功效的一類微生物的總稱[5]。研究表明，益生菌具有抑制病原菌促進腸道健康[6]、提高人體免疫力[7]、降低血清膽固醇[8]等功能。目前國際上常用的益生菌主要來自乳酸桿菌和雙歧桿菌，其中LGG菌代表的鼠李糖乳桿菌備受關注。已有研究指出鼠李糖乳桿菌具有調節腸道微生物菌群平衡，參與機體免疫穩態，宿主營養物質代謝的生物學功能[9-10]，但其對腸道菌群平衡的具體作用還有待深入研究。

本研究將用頭孢曲松和鼠李糖乳桿菌投用幼鼠、詳細地分析頭孢曲松引起的小鼠幼年期腸道菌群失調、腸管上皮細胞組織及機體損傷、同時深入地探索鼠李糖乳桿菌的改善效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

36只四周齡大的SPF級Balb/c小鼠，購買于四川省人民醫院(四川省醫學科學院)實驗動物研究所。飼養于四川大學華西公共衛生學院動物中心IVC系統中。室溫(23±1)℃，濕度50%～70%，自由飲食，12h晝夜節律。

1.2 試劑與材料

頭孢曲松(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；無水乙醇(成都金山化學試劑有限公司)；糞便細菌DNA提取試劑盒(北京天根生化科技北京有限公司)；鼠李糖乳桿菌GG菌株(Lactobacillus rhamnosus,GG)來自于丹麥科漢森；二代測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 實驗流程及分組

36只四周齡大的小鼠適應性喂養3d后被隨機分為3組，每組12只，分別為實驗組、抗生素組和空白組。實驗共計4周。實驗組第一周每天灌胃頭孢曲松(40mg/d/只)和鼠李糖乳桿菌懸液(109CFU/只)，之后停止干預繼續喂養至實驗結束。抗生素組為陽性對照組，第一周每天灌胃頭孢曲松(40mg/d/只)，之后停止干預。空白組第一周每天灌胃生理鹽水，之后停止干預。從實驗第一天開始，每3天測一次體重，記錄體重增長情況。每周采集小鼠糞便，提取小鼠糞便細菌DNA，qPCR分析糞便總菌群濃度變化。二代測序分析小鼠第一周和第四周糞便菌群結構。實驗末期處死小鼠后，比較各組臟器系數以及對各組進行腸道病理學檢測。

1.4 組織病理學檢測

實驗末處死小鼠后，以盲腸為界收集小鼠結腸及回腸各約1cm，10%甲醛固定后做組織切片。HE染色觀察回腸及結腸結構。每組內每張切片挑選100倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件以右下角100倍標尺為標準，每張切片選取5根完整的絨毛，分別測量絨毛高度(mm)、腸腺深度(mm)，并作統計學分析。

1.5 糞便DNA提取及細菌定量

每周收集小鼠糞便，共計4次，-80℃凍存。嚴格遵照糞便基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取糞便DNA。qPCR測定小鼠糞便細菌總量。qPCR反應條件如下：95℃預熱1min，94℃解鏈20s，55℃退火20s，72℃延伸50s，共40個循環。根據大腸埃希菌標準曲線計算糞便樣品的細菌濃度，具體實驗方法參考之前的研究[11]。

1.6 二代測序

瓊脂糖凝膠電泳檢測待測序DNA的純度和濃度，并進行文庫構建，使用HiSeq進行上機測序，之后基于有效數據進行OTUs聚類和物種分類分析。具體實驗方法參考之前的研究，并做部分修改[4]。

1.7 統計學分析

采用GraphPad Prism 7.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量資料用(均數±標準差)(±s)表示，組間均數比較符合正態用方差分析；不符合正態采用wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠體重變化

每3d測量1次體重，見圖1。投用抗生素后，與空白組相比，實驗組和抗生素組小鼠體重增長均減緩，第3、6、9天實驗組和抗生素組體重均低于空白組(P＜0.05)。實驗組于12d體重與空白組差異無統計學意義，抗生素組于21d體重與空白組相比差異無統計學意義。實驗組體重恢復比抗生素組快。

2.2 3組臟器系數比較

實驗末處死小鼠后計算每只小鼠的肝臟臟器系數，由圖2可知，抗生素組低于空白組和實驗組(P＜0.01)(圖2)。

2.3 腸組織病理檢測

第四周3組回腸絨毛細長排列整齊，結腸隱窩明顯(圖3)。抗生素組回腸腸腺深度低于空白組(P＜0.05)，而實驗組與抗生素組和空白組均無統計學差異(圖4)。

2.4 糞便細菌濃度分析

圖1 3組小鼠隨年齡增長的體重變化Fig.1 Body weight of mice in three groups

圖2 3組肝臟臟器系數比較 Fig.2 Liver index of mice in three groups

投用抗生素后，實驗組和抗生素組第一周和第二周糞便細菌濃度均顯著低于空白組(P＜0.05)。第四周實驗組糞便細菌濃度低于抗生素組和空白組(P＜0.05)(表1)。

2.5 腸道菌群多樣性分析

圖3 3組回腸及結腸的病理組織切片(蘇木精-伊紅染色，×100)Fig.3 Intestinal tissues morphologic development of mice in three groups

圖4 3組回腸及結腸絨毛長度、腸腺深度 Fig.4 The depth of crypt in ileum of mice in three groups

等級聚類曲線(rank abundance)以OTUs的排序編號為橫坐標，OTUs中的相對豐度為縱坐標。曲線在橫軸上的跨度越大，其物種豐富度越高，垂直方向曲線越平滑表示樣本的物種分布越均勻。由圖5可知，第一周投用抗生素后，實驗組和空白組的物種豐富度和均勻度相似，而抗生素組物種豐富度大于實驗組和空白組。停止抗生素干預，第四周3組曲線走向一致，物種豐富度和均勻度相似。

Alpha多樣性通常用于分析各組內微生物群落多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標。Shannon指數和Simpson指數都是用來估算樣品中微生物多樣性指數之一。其值越大，說明群落多樣性越高。抗生素投用一周后，實驗組和抗生素組的Shannon指數，Simpson指數均顯著降低(P＜0.05)(表2)。相較于抗生素組，實驗組的Shannon指數，Simpson指數有增高趨勢。第一周實驗組和抗生素組的Shannon指數及Simpson指數顯著降低表明，抗生素的投用降低了受試小鼠腸道菌群多樣性，引起了腸道菌群紊亂。停止干預3周后，抗生素組的Shannon指數、Simpson指數均顯著地高于空白組和實驗組，實驗組的Simpson指數與空白組差異無統計學意義，說明抗生素造成的腸道菌群紊亂在抗生素停用3周內無法完全得到自然恢復、同時使用鼠李糖乳桿菌有利于紊亂的腸道菌群恢復到正常水平。3組樣品的goods_coverage均在0.99以上，表明樣品測序深度足夠，覆蓋率高。

表1 糞便細菌濃度 (log10 CFU/g)Tab.1 Fecal bacteria concentration of mice in three groups

圖5 3組等級聚類曲線比較 Fig.5 Rank abundance of three groups

表2 各組糞便樣品群落多樣性比較Tab.2 Fecal bacteria diversity analysis of three groups

2.6 小鼠腸道菌群組成分析

Venn圖是根據OTUs聚類分析結果制成，可用于分析不同組間共有及特有的OTUs。由圖6可知，第一周抗生素干預后，3組共有物種有221種，其中空白組和實驗組的特有物種分別為59種和69種，而抗生素組有680種特有物種。抗生素組特有物種顯著高于空白組和實驗組，表明單獨使用抗生素后原本優勢菌群可能受到抑制，使某些原本處于抑制狀態的菌種(多數為條件致病菌)異常生長。停止干預3周后，3組共有物種增加到283種，此時空白組有152種特有物種，而實驗組和抗生素組分別有60種和79種。

圖6 各組小鼠糞便樣品Venn圖Fig.6 Venn graph of three groups

圖7 門水平上的物種相對豐度柱形圖Fig.7 OUT relative abundance of three groups at the phylum level

觀察3組門水平上的群落結構組成情況(圖7)。第一周，空白組主要為厚壁菌門(37.78%)和擬桿菌門(60.75%)。而實驗組和抗生素組主要為厚壁菌門。停止干預3周后，空白組依舊以厚壁菌門(45.58%)和擬桿菌門(53.54%)為主。此時實驗組和抗生素組的厚壁菌門有所減少，實驗組腸道中以厚壁菌門(56.78%)、擬桿菌門(28.83%)和疣微菌門(13.99%)為優勢菌；抗生素組菌群相對豐度依次為厚壁菌門(63.38%)、擬桿菌門(22.57%)和疣微菌門(13.53%)。組間差異物種分析，門水平上第一周實驗組有3類菌群與空白組差異有統計學意義，抗生素組有7類菌群。停止干預3周后實驗組有2類菌群相對豐度與空白組存在差異，而抗生素仍有4類菌群。從屬水平上看(圖8)，第一周實驗組Lactobacillus屬的相對豐度高于抗生素組和空白組，但停止投用鼠李糖乳桿菌懸液后，第四周實驗組Lactobacillus屬相對豐度明顯減少。組間差異物種分析，第四周抗生素組Parasutterella、Alistipes、Parabacteroides屬的相對豐度大于空白組，而實驗組與空白組無差異。實驗組Lactobacillus屬相對豐度顯著小于空白組和抗生素組(P＜0.05)。

主坐標分析(PCoA)是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數據中提取出最主要的元素和結構。橫坐標表示一個主成分，縱坐標表示另一個主成分，百分比表示主成分對樣本差異的貢獻值；圖中每個點表示一個樣本，同一組的樣本使用同一種顏色表示。樣本距離越接近，表示物種結構越相似，因此群落結果相似度高的樣本傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣本則會遠遠分開。由圖9可知，第一周的實驗組和空白組以及第四周的3組能聚集在一起，群落結果相似度高。而第一周的抗生素組樣本與其他組遠遠分開，群落差異較大。

3 討論

近年來，人們對抗生素的副作用日益關注，尤其是其對兒童青少年的影響。有研究表明抗生素對正常成年人腸道菌群的影響是短暫可逆的，但由于生命早期是機體腸道菌群更替成熟的特殊時期，抗生素對兒童青少年的影響更加深遠更加長久[12]。抗生素在現代醫療中占有舉足輕重的作用，因此尋找改善抗生素引起的腸道菌群失調的方法至關重要。本實驗用頭孢曲松持續灌胃四周齡小鼠一周，造成生命早期腸道細菌群紊亂模型并使用益生菌干預，研究益生菌對菌群紊亂的改善效果。

圖8 屬水平上的物種相對豐度柱形圖Fig.8 OUT relative abundance of three groups at the genus level

圖9 3組主坐標分析(PCoA) Fig.9 Principal co-ordinates analysis of three groups

研究結果表明，實驗18d及之前抗生素組的體重低于空白組，表明抗生素對幼鼠體重增長有負面作用。停止干預后，益生菌組體重恢復速度快于抗生素組。體重的增長與機體的營養攝入有關，腸道是機體消化吸收的重要部位。腸黏膜形態結構的完整性是腸道發揮功能的基礎保障，絨毛高度、隱窩深度是反映腸黏膜形態結構完整性的重要指標。比較3組腸道病理形態，結果顯示，抗生素組隱窩深度低于空白組，證實了抗生素對腸道形態學的影響，這與之前的研究一致[4]。而實驗組與空白組差異無統計學意義，說明益生菌的投用能一定程度上逆轉抗生素所引起的腸道黏膜結構的改變。肝臟具有代謝解毒的功能，是新陳代謝的重要器官，肝臟臟器系數比較，抗生素組低于空白組和實驗組，也說明了抗生素對機體的損害作用和益生菌的恢復作用。

腸道微生物和機體是一種相互依存相互制約的關系，當微生態處于平衡狀態時，腸道內正常微生物菌群對腸道的結構和功能起著至關重要的作用[13]。本研究中抗生素干預一周后，抗生素組和實驗組的受試小鼠糞便菌群總量均顯著低于空白組，停止干預后受試小鼠糞便細菌濃度迅速增長。空白組糞便細菌濃度從第一周到第四周均數逐漸降低，第四周糞便細菌濃度低于第一周，表明隨著年齡的增長，糞便細菌濃度有一個降低的過程。第四周，實驗組受試小鼠糞便細菌濃度低于空白組和抗生素組，說明鼠李糖乳桿菌樣的益生菌早期干預可能會以某種方式影響糞便細菌的增殖，甚至低于自然恢復的抗生素組。

等級聚類曲線能直觀的反映3組糞便細菌的物種豐富度和均勻度。實驗結果顯示，抗生素干預一周后，抗生素組曲線平滑橫軸跨度大，與空白組相比差異較大，表明抗生素對菌群的紊亂作用；實驗組益生菌干預后，與空白組曲線走向相似，說明就物種豐富度和均勻度來看，在抗生素紊亂腸道菌群的同時投用益生菌，有利于腸道菌群的平衡。第四周，3組曲線走向相似，表明即使不使用益生菌干預，機體也有一定的自愈能力。但在抗生素紊亂的同時給與益生菌改善治療有利于機體腸道菌群及時恢復。另外，第4周實驗組的Simpson指數與空白組無差異，抗生素組Simpson指數高于空白組和實驗組；Shannon指數比較，抗生素最高，實驗組次之，空白組最低。這些結果也表明了抗生素對菌群的紊亂作用和益生菌對其的改善效果。研究結果可以看出相較于空白組第一周抗生素組物種豐富度增高，物種分布更均勻，4周后抗生素組腸道菌群多樣性更高。抗生素的使用引起菌群多樣性提高有可能是由于投用抗生素抑制了優勢菌群的生長，使原來被抑制的微量存在的菌種(其中不少屬于條件病原菌)異常生長，可能會有害宿主健康，這種變化甚至在抗生素停止使用仍在繼續。本研究結果表明抗生素導致腸道菌群的異常不僅表現在抗生素投用期間而且持續到生命的后期。現有研究大多把物種分布均勻，豐富度及多樣性增高看作是衡量菌群健康的標志，此次結果也說明今后在研究時不能僅以菌群豐富度、均勻度或多樣性作為衡量菌群穩態的標志，需參考其他信息綜合評判。

腸道菌群組成分析，在分類學門水平上無論是第一周還是第四周，實驗組與空白組的差異均小于抗生素組與空白組的。屬水平上，第四周抗生素組Parasutterella、Alistipes、Parabacteroides的相對豐度大于空白組，而實驗組與空白組無差異。Chen等[14]認為Parasutterella的豐度與腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)呈正相關關系；而Alistipes豐度與IBS患者腹部疼痛次數相關[15]，并且與體重、血脂水平呈正相關[16]。Parabacteroides作為條件致病菌具有一定的耐藥性與多種感染性疾病有關[17]。投用鼠李糖乳桿菌GG株菌懸液后，第一周Lactobacillus作為實驗組的優勢菌群，相對豐度明顯高于抗生素組和空白組，然而停止干預后第四周實驗組Lactobacillus的相對豐度低于空白組和實驗組，表明在抗生素紊亂腸道菌群的同時投用益生菌，可能會干擾益生菌的定植，使Lactobacillus的相對豐度甚至不如自然恢復的抗生素組。但益生菌的投用對菌群多樣性有所改善，說明單獨投用一種菌可能并不能使這種菌成為優勢菌，而是通過某種方式改善了菌群結構，其改善機制可能還需要進一步的研究。

主坐標分析比較3組微生物群落構成，以期發現不同組間的差異。結果顯示第一周抗生素組聚類不如實驗組，說明在抗生素干預的同時使用益生菌干預能幫助宿主迅速建立正常的菌落結構，有效改善抗生素誘導的腸道菌群紊亂。盡管4周后3組群落結果相似度高，表明不使用益生菌機體腸道菌群自行也能恢復，但菌群群落結構恢復不如實驗組及時。

綜上，本研究證明生命早期投用抗生素能顯著影響體重及腸道組織發育，抗生素引起的菌群紊亂可能是機制之一。在抗生素干預的同時投用益生菌能有效抑制某些菌群的生長，使腸道菌群結構盡量保持穩定，在一定程度上改善抗生素對機體的損傷作用。