血流感染CRKP的臨床特點及高毒力血清型分析

付玉冰 董愛英,* 汪亞斯 張嫘 黃軍祉 周海健

(1 華北理工大學附屬醫院，唐山 063000；2 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206)

肺炎克雷伯菌是臨床常見的醫院感染條件致病菌，可導致肺炎、敗血癥、肝膿腫等多種感染[1]。隨著碳青霉烯類藥物越來越廣泛的應用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae, CRKP)呈逐年上升趨勢，使抗生素選擇性壓力愈加嚴重，增加了患者的治療難度且死亡率較高。近年來，國內外對新出現的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiella pneumoniae,hvKP)的研究報道有很多，而對于hvKP菌血癥的相關報道卻并不多見。由于我院近期CRKP血流感染死亡率的大幅提升，給臨床工作帶來了很大的困擾，因此本研究旨在了解我院CRKP血流感染患者的臨床特征，分析CRKP高毒力血清型的分布情況，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

連續收集我院2016年11月—2017年9月臨床血培養標本中分離出的肺炎克雷伯菌，篩選出CRKP 22株(同一患者分離的相同菌株不重復記錄)。

1.1.2 主要儀器和試劑

Phonenix-100全自動細菌鑒定/藥敏系統及配套試劑由美國BD公司生產；PCR擴增儀由德國Eppendorf公司生產；電泳儀由美國BioRad公司生產；PCR試劑由上海生物工程有限公司生產；培養基和替加環素MIC測試條由溫州康泰生物科技有限公司生產；藥敏紙片由英國Oxoid公司生產。

1.1.3 質控菌株

大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和金黃色葡萄球菌ATCC25923為藥敏質控菌株；肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705為改良Hodge試驗陽性對照菌株、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706為改良Hodge試驗陰性對照菌株。質控菌株均購自溫州市康泰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗

采用美國BD公司生產的Phonenix-100全自動細菌鑒定/藥敏系統、聯合紙片擴散法(K-B法)進行菌株鑒定和藥敏試驗。替加環素藥敏試驗方法為E-test法。藥敏結果判讀參照美國臨床實驗室標準化研究協會(CLSI)M100-S26文件2017年推出的判讀標準[2]。

1.2.2 表型檢測

采用改良Hodge試驗篩查碳青霉烯酶表型，EDTA協同試驗篩查金屬β-內酰胺酶。

1.2.3 PCR檢測khe基因、耐藥基因及血清型

煮沸法制備DNA模版，采用PCR方法擴增肺炎克雷伯菌的體外溶血酵素基因khe，2種常見耐藥基因(blaKPC、blaIMP)和6種高毒力血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)。PCR引物見表1，反應體系和反應條件見參考文獻[3-4]。PCR擴增產物經基因測序后與GenBank基因庫中的已知序列進行Blast比對。

2 結果

2.1 表型確認試驗

改良Hodge試驗結果顯示，22株CRKP均為陽性，陽性率為100.0%。

2.2 khe基因檢測

用PCR方法篩選肺炎克雷伯菌體外溶血酵素基因(khe)，結果均為陽性。圖1表明血培養標本分離到的菌株均為肺炎克雷伯菌。khe擴增條帶大小為428bp，與理論值相符。

2.3 耐藥基因檢測

PCR擴增結果見圖2，22株CRKP中有17株攜帶blaKPC基因，檢出率為77.3%，未檢出blaIMP基因。

2.4 高毒力血清型檢測

2.4.1 PCR基因擴增及序列對比

PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，通過凝膠成像儀可見待測菌株的目的基因條帶，結果見圖3。PCR擴增產物經基因測序后與GenBank基因庫中的已知序列進行Blast比對。

2.4.2 高毒力血清型檢出情況

22株CRKP有5株檢出高毒力血清型，檢出率為22.7%。其中K1型1株，占4.5%；K5型2株，占9.1%；K20型2株，占9.1%。

表1 細菌PCR靶標與引物Tab.1 Primers used in this study

圖1 臨床肺炎克雷伯菌khe基因PCR擴增結果Fig.1 Results of PCR amplification of khe gene

圖2 耐藥基因PCR擴增結果Fig.2 Results of PCR amplification of drug resistant gene

2.4.3 高毒力CRKP菌株分布及臨床特點

圖3 高毒力血清型PCR擴增結果Fig.3 Results of PCR amplification of hypervirulent serotypes

我院2016年11月—2017年9月共檢出血流感染CRKP22例，其中有5例存活，17例死亡，死亡率達77.3%。患者平均年齡為66歲，平均住院時間為28d，有導管留置或使用呼吸機的患者占59.1%。患者多有較重的心腦血管疾病或呼吸系統疾病等，科室分布主要在重癥醫學科(59.1%)，神經內科重癥病房(22.7%)，泌尿外科(9.1%)，血液科(4.5%)等。PCR擴增結果顯示，22株CRKP有5株檢出高毒力血清型，并且主要分布在不攜帶blaKPC基因的菌株中，其中K1型1株，為不產KPC菌株；K5型2株，均為不產KPC菌株；K20型2株，有一株為不產KPC菌株。檢出高毒力CRKP菌株的患者死亡率為80.0%。具體情況見表2。

2.4.4 CRKP菌株毒力與耐藥情況

將5株毒力菌株與17株非毒力菌株的藥敏結果進行比較，結果見表3。22株CRKP對亞胺培南和美羅培南的耐藥率為100%，對替加環素和多黏菌素完全敏感，毒力菌株與非毒力菌株對復方磺胺甲噁唑的耐藥率差別不大，分別為60.0%和52.9%，但對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率差別較大，表現為毒力菌株對氨基糖苷類抗生素的耐藥率更低。

表2 高毒力CRKP菌株分布及臨床特點Tab.2 The distribution of hypervirulent serotype and clinical characteristics of CRKP

表3 CRKP菌株毒力與耐藥情況Tab.3 The hypervirulent serotypes andresistance of CRKP

3 討論

目前，CRKP引起的血流感染已經較為常見，并且主要是醫院獲得性感染，特別是在重癥監護病房，因患者病情危重，免疫力低下，一旦發生導管留置易引起導管相關血流感染，治療困難且死亡率較高[5]。在本次研究中，CRKP患者的病區主要分布在重癥醫學科(59.1%)，神經內科重癥病房(22.7%)，泌尿外科(9.1%)，血液科(4.5%)等，患者年齡偏大，住院時間較長，有心腦血管疾病或呼吸系統疾病等。在22例CRKP血流感染的患者中，有5例存活，17例死亡，死亡率達77.3%，死亡的患者大多采用了中心靜脈導管、呼吸機等有創操作。由美國CDC2013年公布的數據顯示，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌引起的血流感染死亡率達50.0%，約6.5%的患者死于CRKP[6]，由此可見我院CRKP血流感染的死亡率較高，是威脅患者生命的重要危險因素。

khe基因僅存在于肺炎克雷伯菌中，編碼大小為19kDa的蛋白，可能有溶血素活性，因此可作為鑒定肺炎克雷伯菌的特異性靶標[7]。本研究中的22株肺炎克雷伯菌的khe基因PCR檢測結果均為陽性，再次證實了khe基因作為肺炎克雷伯菌標示序列的可靠性。

20世紀80年代，臺灣學者首次發現肺炎克雷伯菌性肝膿腫，并提出了hvKP[8]。hvKP毒力的增加主要與莢膜多糖、鐵攝取系統及毒力基因有關，其中莢膜多糖是肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，可有效介導菌體逃避或抵抗宿主的免疫殺傷和保護細菌免受中性粒細胞的吞噬[9]。根據莢膜多糖(K抗原)分型，可將肺炎克雷伯菌分為82個K血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54和K57血清型與人和動物各種侵襲性感染密切相關，被認定為高毒力血清型肺炎克雷伯菌。根據文獻報道[10]，wzy_K1、wzy_K2、wzx_K5、wzy_K20、wzx_K54和wzx_K57分別為這6種高毒力血清型的特異性靶基因，因此，本研究根據參考文獻[11]合成了相應的引物，利用PCR的方法進行血清型鑒定。結果顯示22株CRKP有5株檢出高毒力血清型，檢出率為22.7%，其中K1型1株(占4.5%)，K5型2株(占9.1%)，K20型2株(占9.1%)，與吳華等[12]報道不相符，其中K1和K2血清型的比例較少，經分析可能與本研究標本量較少或地區差異有關。

Jung等[13]提出細菌為了獲得耐藥基因以取得最佳適應而丟棄一些毒力因子，因此本研究也關注了細菌毒力與耐藥基因之間的關系。依據楊麗君等[14]報道，blaKPC和blaIMP為本地區最主要的耐藥基因，因此在本次試驗之前已經對這兩種耐藥基因進行篩查，結果有17株CRKP檢出blaKPC基因，未檢出blaIMP基因。經研究發現高毒力CRKP主要分布在不攜帶耐藥基因的菌株中，并且有90.0%以上的非毒力菌株攜帶耐藥基因，說明致病力較高的CRKP可能對藥物的敏感度更高。另外本試驗分離到1株產KPC酶基因的K20菌株，這與張嶸等[15-16]試驗結果一致，說明越來越多的研究在CRKP菌株中檢出產KPC的高毒力菌株。

毒力菌株與非毒力菌株的藥敏結果顯示，22株CRKP對碳青霉烯類抗生素的耐藥率為100%，對替加環素和多黏菌素完全敏感，毒力菌株與非毒力菌株對復方磺胺甲噁唑的耐藥率差別不大，分別為60.0%和52.9%，但對氨基糖苷類抗生素的耐藥率差別較大，表現為毒力菌株對氨基糖苷類抗生素更敏感，這與程穎等[17]研究發現的hvKP藥物敏感率大于經典肺炎克雷伯菌的說法一致，為兩者所引起血流感染的臨床用藥及預后差別提供了實驗室依據。

由此可見，我院血流感染CRKP菌株存在高毒力血清型，提示臨床醫生應提高對hvKP的注意，重視血流感染的診治與控制，為患者提供良好的就醫環境。本次研究的標本量較少，使試驗結果存有一定的局限性，因此，本研究下一步計劃探究碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌與CRKP的毒力差異、呼吸道感染與血流感染CRKP的毒力差異，從而更加有針對性地防控和治療CRKP引起的相關感染。