微生物來源抗腫瘤先導化合物的靶向篩選研究

田敏 陳嘉 張鵬 俞巖青 王昆蓉 曹艷茹 雷葉明 鐘艾玲 朱輝

(1 成都大學，四川抗菌素工業研究所，成都 610052；2 成都雅途生物技術有限公司，微生物藥物生物合成技術國家地方聯合工程研究中心，成都 610041)

惡性腫瘤是危害人類生命健康和社會發展的重大疾病，在我國，隨著工業化、城鎮化和人口老齡化進程的加快，加之不良生活習慣以及環境污染等問題的存在，癌癥發病率和死亡率日益增加[1]。盡管不斷有新的抗癌藥物應用于臨床，但在臨床治療過程中，抗腫瘤藥物仍面臨毒性大、治療適用范圍窄、易產生耐藥性等問題，需要持續不斷地研究、開發新型抗腫瘤藥物。因此，世界主要國家均將抗腫瘤藥物列為國家重點研發計劃品種，預防、控制和治療癌癥已成為全球最重要的公共醫療問題之一。

研究表明由Vezina等[2]1975年發現的雷帕霉素對惡性腫瘤細胞具有抑制作用，能有效抑制腎移植患者的皮膚卡波西肉瘤，其結構修飾衍生物依維莫司(everolimus)近年來先后被美國和歐洲批準用于治療晚期腎細胞癌、伴有與結節狀腦硬化(TSC)相關的室管膜下巨細胞星形細胞瘤(SEGA)、惡性胰腺神經內分泌腫瘤(PNET)、HR陽性HER2陰性乳腺癌、腎血管平滑肌脂肪瘤，以及年幼兒童罕見腦腫瘤的治療[3]。其母核(雷帕霉素)結構引起各國藥物研究者的重視，具有廣泛、深度的開發前景。

本研究以具有抗腫瘤活性的化合物雷帕霉素胞內結合蛋白RBP為靶標，該RBP蛋白具有PPIase活性，可催化肽酰脯氨酰胺鍵的順-反式異構轉化，使肽鏈折疊。將RBP的編碼基因克隆到啤酒酵母菌中，并將其構建為氨基酸營養依賴型重組微生物，應用所構建的基因重組工程菌作為模型篩選菌株，通過微生物的存活，快速、便捷的篩選特異性的雷帕霉素結構類似物。本文主要報道從微生物次級代謝產物中經篩選獲得的活性化合物產生菌的初步鑒定、活性化合物的分離純化及結構研究。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與試劑

儀器：PCR儀(Thermal Cycler)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；生化培養箱(上海精宏實驗設備有限公司，GNP-9160型)；潔凈工作臺(蘇州凈化，SW-CJ-2FD型)；發酵罐(上海保興生物設備工程有限公司)；離心機(上海安亭科學儀器廠，TD-L40B)；高效液相色譜儀(Aglient, 1200 Series)；DAC層析柱(北京創新通恒科技有限公司，50mm)；真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司，DZF-6020型)；紫外掃描儀(島津UV-2450)；紅外儀(島津IRAfinity-1s)；高分辨質譜(MicroTOF QII)；核磁共振波譜儀(Bruker Advance 600型)。

試劑：PCR擴增酶及擴增引物(上海生工生物工程有限公司)；硅膠(青島美高集團有限公司，150～250目)；C18硅膠(Kromasil, 10μm)；乙酸乙酯、丙酮、正己烷、乙腈、甲酸和甲酸銨等分析純試劑(成都市科龍化工試劑廠)。

1.2 實驗菌株

篩選模型用重組微生物工程菌RS及RS-N由本試驗室保藏；活性化合物產生菌CY-365分離自四川阿壩地區土壤，保藏于四川抗菌素工業研究所菌種保藏中心。

1.3 培養基

固體斜面培養基(g/L)：葡萄糖4，酵母粉4，麥芽抽提物10，CaCO32，瓊脂25，pH7.0。種子培養基(g/L)：甘油10，可溶性淀粉10，葡萄糖5，黃豆粉20，CaCO32，pH7.0。發酵培養基(g/L)：甘油10，可溶性淀粉10，葡萄糖5，黃豆粉40，NaCl 2，賴氨酸5，MgSO4·7H2O 2，CaCO32，pH7.0。重組微生物工程菌培養用培養基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉10，蛋白胨15，瓊脂20，pH6.5。

2 試驗方法

2.1 模型篩選

采用攜帶雷帕霉素細胞內結合蛋白RBP外源靶位基因的2株營養依賴型重組酵母工程菌篩選系統，對微生物來源的化合物樣品進行篩選，根據兩株基因工程菌對所試樣品的敏感性和耐受性情況(表1)， 特異性地尋找雷帕霉素及其結構類似物。

2.2 菌株分子鑒定

取CY-365菌體適量，加入5% Chelex 100 100μL，100℃水浴10min，12000r/min離心3min，留取上清液進行16S rDNA擴增[4]，上游引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)，下游引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR擴增采用50μL反應體系包括DNA模板2μL，上游引物27F(10μm)5μL，下游引物1492R(10μm)5μL，Buffer(10×)5μL，Taq酶0.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1.5μL，ddH2O 31μL；PCR反應條件為94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環。擴增產物經GoldView染色，瓊脂糖凝膠電泳、回收，送成都擎科生物公司測序。測序結果提交NCBI的BLAST進行多序列相似性比對分析，利用MEGA7.0計算序列間的相似性并繪制系統進化樹[5]。

2.3 菌株CY-365的培養

無菌條件下刮取適量CY-365菌株的孢子，涂布接種于斜面培養基上，于28℃生化培養箱中培養10d后，將生長成熟的斜面培養物，挖塊接種于500mL種子培養瓶中，培養基裝量150mL，于28℃，220r/min 條件下培養3d，培養物按10%接種量接種于10L發酵罐，28℃，500r/min，空氣1:1(vvm)條件下培養6d，收集發酵液。

2.4 活性產物的分離提取

表1 篩選模型Tab.1 Screening model

CY-365深層發酵培養物10L，經離心進行固液分離，棄上清液，菌絲體用3倍體積乙酸乙酯抽提[6]，抽提液減壓濃縮后上樣于正相硅膠柱層析，分別用15%、20%和25%丙酮/正己烷梯度洗脫，TLC、HPLC檢測跟蹤洗脫進程，分步收集，合并目標組分純度大于70%的洗脫液，40～50℃、P≤-0.08MPa減壓濃縮至干，用乙腈溶解后經降溫結晶 ，過濾，真空干燥得粗品2.8g。

將粗品加入200mL乙腈溶解完全，加水至500mL，經DAC反相C18層析，55%乙腈洗脫，HPLC檢測，合并純度大于95%的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液加乙酸乙酯萃取，分離萃取液濃縮至干，加乙腈溶解，降溫結晶，過濾，真空干燥制得CY-365純品918mg。

2.5 理化性質和結構鑒定

將經分離純化得到的化合物CY-365進行理化分析以及IR、UV、MS、NMR波譜檢測，并對各波譜信息進行波譜解析。

2.6 HPLC分析條件

色譜柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm, 5μm)；流動相A：水(1000mL含0.63g甲酸銨，1mL甲酸)；流動相B：乙腈；A:B=70:30；流速：1.0mL/min；紫外檢測波長：277nm；柱溫：50℃。

3 結果

采用攜帶雷帕霉素細胞內結合蛋白RBP外源靶位基因的重組酵母工程菌篩選系統，經對4000余個微生物來源樣品進行篩選，獲得一個陽性菌株CY-365。

3.1 菌種分類鑒定

菌株CY-365的16S rRNA基因序列經過擴增并測序，16S rDNA序列經過NCBI的BLAST比對，利用軟件MAGE7.0繪制系統發育樹(圖1)。菌株CY-365與Streptomycessp.MM9(KU714924.1)的同源性達99%。

3.2 活性化合物結構鑒定

化合物CY-365為白色不定性粉末，可溶于丙酮、乙腈、乙醇，在乙醚中微溶，在水中幾乎不溶。化合物紫外吸收在277.4nm處有高強K吸收帶，表明分子中有3個共軛體系存在。化合物紅外光譜在波數3417.86cm-1有中等強度吸收，說明分子中含有羥基(OH)；在波數2968.45、2931.80和2873.94cm-1有吸收，說明分子中含有飽和烴(CH3、CH2)；在波數1718.58cm-1有最強吸收，說明分子中含有羰基(C=O)；在波數1645.28和1633.71cm-1有吸收，說明分子中含有雙鍵(C=C)；在波數1450.47和1377.17cm-1有吸收，說明分子中有CH3和CH2。

化合物CY-365的ESI-MS顯示分子離子峰m/z950.5622[M+Na]+，高分辨數據表明化合物分子式為C52H81NO13。

化合物CY-365的1H NMR、13C NMR(DEPT)及HSQC的相關性顯示：化合物含有52個碳的信號，包括10個甲基(CH3)，14個亞甲基(CH2)，20個次甲基(CH)和8個季碳(C)；其中化合物含有5個羰基碳(C=O)、2個甲氧基(CH3O)。由1H-1H COSY可知，CH-2、CH2-3、CH2-4、CH2-5、CH2-6存在依次相關信號，根據HMBC相關信號，CH-2、CH2-3、CH2-4、 CH2-5、CH2-6應依次連接成雜環，同時次甲基碳CH-2與羰基碳C-1連接。由1H-1H COSY可知，CH-10、 CH2-11、CH2-12、CH-13、CH2-14、CH-15存在依次相關信號，甲基碳CH3-10a與次甲基碳CH-10相連，再根據HMBC相關信號，CH-10、CH2-11、CH2-12、CH-13、CH2-14、CH-15依次連接，季碳C-9與次甲基碳CH-10相連，次甲基CH-15與亞甲氧基CH2O-15a相連。由1H-1H COSY可知，CH2-15a和CH3-15b相關，再根據HMBC相關信號可知，次甲基CH-15與乙氧基相連。由1H-1H COSY可知，CH-17、CH-18、CH-19、CH-20、CH-21、CH2-23和CH-24存在依次相關信號，甲基碳CH3-22a與CH-22連接，甲基碳CH3-24a與CH-24連接，再根據HMBC相關信號，CH-17、CH-18、CH-19、CH-20、CH-21、CH2-23和CH-24依次連接，季碳C-16與CH-15、CH-17和CH3-16a連接，羰基碳C-25與CH-24和CH-26連接。化合物CY-365的CH-17、CH-18、CH-19、CH-20、CH-21氫譜化學位移顯示，CH-17、CH-18、CH-19、CH-20、CH-21為依次相連的共軛烯烴。由1H-1H COSY可知，CH-26、CH-27相關，且氫譜化學位移顯示為與氧相連，再根據HMBC相關信號，次甲基CH-26與甲氧基CH3O-26a相連。由1H-1H COSY可知，CH-29、CH-30、CH3-30a依次相關，再根據HMBC相關信號，CH-29、CH-30、CH3-30a依次相連，季碳C-28與CH-29和CH3-28a相連，羰基碳C-31與CH-30和CH2-32相連。由1H-1H COSY可知，CH2-32、CH-34、CH2-35、CH-36依次相關，甲基碳CH3-34a與CH-34相連，再根據HMBC相關信號，CH2-32、CH-34、CH2-35、CH-36依次相連。由1H-1H COSY可知，CH-36、CH2-37、CH2-38、CH-39、CH-40、CH2-41、CH-36依次相關，再根據HMBC相關信號，CH-36、CH2-37、CH2-38、CH-39、CH-40、CH2-41、CH-36依次連接成六員環，次甲基CH-40與甲氧基CH3O-40a相連。化合物CY-365的1H NMR、13C NMR(DEPT)、HSQC、1H-1H COSY、HMBC數據見表2。

圖1 菌株CY-365與相關菌株系統發育樹Fig.1 Neighbour-Joining phylogenetic tree of CY-365 and relative strains

表2 化合物CY-365的1H NMR、13C NMR(DEPT)、HSQC、1H-1H COSY、HMBC數據(溶劑為CDCl3)Tab.2 1H NMR, 13C NMR(DEPT), HSQC, 1H-1H COSY and HMBC data for compound CY-365 in CDCl3

續表2

綜合UV、IR、ESI-MS和核磁分析，化合物CY-365含有羰基和共軛烯烴等基團，含有52個碳(10個甲基、14個亞甲基、20個次甲基、8個季碳)，含有81個氫(3個羥基活潑氫)，分子式為C52H81NO13，鑒定為15-O-乙基雷帕霉素。有文獻報道[7]，通過雷帕霉素合成15-O-乙基雷帕霉素，其存在順式和反式兩種結構，對比參考文獻中兩種構型的核磁數據，化合物CY-365為15(S)-O-乙基雷帕霉素，其化學結構如圖2所示。

4 討論

圖2 化合物CY-365的結構式Fig.2 The structure of compound CY-365

微生物由于其具有代謝產物結構多樣性的特點，一直是新藥研究的重要源泉。本研究通過以雷帕霉素細胞內結合蛋白RBP為靶位的特異篩選模型，從微生物次級代謝產物中篩選并分離得到化合物CY-365，其產生菌經菌種鑒定為放線菌鏈霉菌屬，化合物CY-365經結構解析研究表明為雷帕霉素的結構類似物乙氧基雷帕霉素，體外試驗顯示與雷帕霉素對胞內結合蛋白RBP具有相同的結合活力。資料顯示，美國家用化學品公司通過發酵培養吸水鏈霉菌NRRL5491曾獲得雷帕霉素類似物脯氨酸雷帕霉素[8]；福建微生物研究所報道采用巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素，獲得26,40-O-雙去甲基雷帕霉[9]，從雷帕霉素產生菌吸水鏈霉菌發酵液中分離微量組分，獲得15-O-去甲雷帕霉素、15-O-乙基雷帕霉素、脯氨酸雷帕霉素、27-異帕雷帕霉素、26-O-去甲雷帕霉素[10]。 上海醫藥工業研究院在構建放線菌NP2-109生物合成雷帕霉素時，采用定點突變的方式獲得34, 35-雙鍵-26-O-去甲雷帕霉素[11]。本研究發現的乙氧基雷帕霉素經立體構型分析確定為15(S)-O-乙基雷帕霉素，由鏈霉菌直接代謝產生，且為鏈霉菌CY365的主要代謝產物，為乙氧基雷帕霉素的制備奠定了物質基礎。對乙氧基雷帕霉素進一步結構修飾及構效關系的深入研究，極有可能為抗癌藥物的源頭創新提供新的母核物質。