miR-92a-3p靶向GPR124調控糖尿病腎病足細胞損傷的機制

王蘊倩 薛磊 李慧聰 時軍 陳寶平

(河南大學淮河醫院 1腎內科，河南 開封 475000；2內分泌科)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發癥之一，也是糖尿病死亡的主要原因〔1,2〕。目前糖尿病的發病率正逐年上升，DN的發生也逐漸增多〔3〕。miRNA是一種小的非編碼RNA，長度為20～25個核苷酸，通過堿基互補配對方式與靶基因3′UTR部分或完全互補，在轉錄后水平調控靶基因的表達〔4〕。據報道，多種miRNAs的表達與DN的發生發展有關〔5〕，其中包括miR-192〔6〕、miR-377〔7〕、miR-21〔8〕。有研究報道，在冠狀動脈〔9〕、人急性白血病〔10〕、紅斑狼瘡〔11〕等多種疾病中miR-92a-3p均出現異常表達。但miR-92a-3p在DN中的作用機制尚未完全清楚。G蛋白耦聯受體(GPR)124為GPR家族的孤兒受體，其與血腦屏障、血管生成關系密切〔12,13〕。孤兒受體GPR124、GPR88參與大鼠的高血壓形成〔14〕，但GPR124在DN中的調控機制尚未十分清楚。本研究擬以高糖誘導的小鼠損傷足細胞為研究對象，檢測miR-92a-3p、GPR124在高糖誘導的損傷小鼠足細胞中的表達，觀察抑制miR-92a-3p、過表達GPR124、敲減GPR124對高糖誘導的損傷小鼠足細胞中結蛋白(Desmin)表達和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 永生型小鼠足細胞購自美國ATCC；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、聚氰基丙烯酰正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒、電化學發光法(ECL)發光液和放射免疫沉淀試驗(RIPA)蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；脂膜蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2細胞培養及模型的構建 用含10 %胎牛血清的RPMI1640完全培養基培養永生型小鼠足細胞，置于37℃,5% CO2的培養箱中常規培養。按照邢玲玲〔15〕的方法建立高糖誘導的小鼠足細胞損傷模型。運用Western印跡、流式細胞術檢測損傷足細胞中Desmin的蛋白表達及凋亡率。

1.3細胞轉染與分組 將anti-miR-92a-3p、anti-miR-NC、pcDNA、pcDNA-GPR124、anti-miR-92a-3p+si-con、anti-miR-92a-3p+si-miR-92a-3p按照脂質體LipofectamineTM2000說明書操作步驟轉染至小鼠足細胞，然后用高糖30 mmol/L處理48 h，分別標記為高糖+anti-miR-92a-3p組、高糖+anti-miR-NC組、高糖+pcDNA組、高糖+pcDNA-GPR124組、高糖+anti-miR-92a-3p+si-con組、高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124組，轉染48 h后，用qRT-PCR檢測轉染效率。轉染成功后，用于后續試驗。

1.4qRT-PCR實驗 取適量對數生長期1.3各組細胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求提取RNA進行定量，然后按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書進行miR-92a-3p和GPR124檢測。用2-△△Ct計算miR-92a-3p和GPR124的表達。

1.5Annexin V-FITC/PI流式細胞術實驗 將1.3各轉染組細胞，用結合緩沖液 500 μl懸浮細胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細胞儀測定。細胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.6Western印跡實驗 收集1.3各組細胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發光液，曝光。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測實驗 熒光素酶報告載體(psiCHECK2-GPR124-WT,psiCHECK2-GPR124-MUT)分別與miR-92a-3pmimics、miR-NC用脂質體法轉染小鼠足細胞，培養6 h后，更換新鮮培養液繼續培養，轉染48 h。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書步驟操作。結果以海參熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值反應miR-92a-3p與GPR124的結合力。

1.8統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1高糖刺激對小鼠足細胞損傷的影響 與對照組(0.32±0.04、6.47%±0.53%)相比，高糖組Desmin蛋白表達(0.86±0.07)顯著升高，細胞凋亡率(24.13%±1.76%)顯著升高(t=11.601、16.641，均P=0.000)。

2.2抑制miR-92a-3p對高糖刺激小鼠足細胞損傷的影響 與高糖+anti-miR-NC組相比，高糖+anti-miR-92a-3p組miR-92a-3p、Desmin蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

2.3敲減GPR124表達逆轉了抑制miR-92a-3p對高糖刺激小鼠足細胞損傷的保護作用 與高糖+anti-miR-92a-3p+si-NC組(0.34±0.03，9.46%±1.37%)相比，高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124組Desmin蛋白表達(0.69±0.07)顯著升高，細胞凋亡率(18.49%±1.42%)顯著升高(P<0.05)，且高糖+anti-miR-NC組、高糖+anti-miR-92a-3p組、高糖+anti-miR-92a-3p+si-NC組、高糖+anti-miR-92a-3p+si-GPR124組Desmin蛋白表達、凋亡率差異有統計學意義(F=46.406、61.995，均P=0.000)，見圖1。

2.4高糖刺激對小鼠足細胞中miR-92a-3p和GPR124表達的影響 與對照組相比，高糖組miR-92a-3p表達顯著升高，GPR124蛋白表達顯著降低(圖2)，GPR124 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.5GPR124過表達對高糖刺激小鼠足細胞損傷的影響 與高糖+pcDNA組相比，高糖+pcDNA-GPR124組GPR124蛋白表達顯著升高，Desmin蛋白表達顯著降低(圖3)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表3。

表1 抑制miR-92a-3p對高糖刺激小鼠足細胞損傷的影響

圖1 Desmin蛋白表達

圖2 GPR124蛋白表達

表2 高糖刺激對小鼠足細胞中miR-92a-3p和GPR124表達的影響

圖3 GPR124和Desmin蛋白表達

組別GPR124蛋白Desmin蛋白凋亡率(%)高糖+pcDNA組0.17±0.040.89±0.0823.76±2.06高糖+pcDNA-GPR124組0.61±0.050.41±0.0414.77±1.34t值11.9029.2956.336P值0.0000.0010.003

2.6miR-92a-3p靶向調控GPR124的表達 運用miRcode數據庫預測到miR-92a-3p與GPR1243′UTR存在結合位點(圖4)；雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-NC組(1.02±0.08、0.98±0.09)相比，miR-92a-3p組WT-GPR124細胞中熒光活性(0.43±0.04)顯著降低(t=11.425,P=0.000)，MUT-GPR124細胞中熒光活性(1.01±0.07)不受影響(t=0.456,P=0.672)；與miR-NC組(0.57±0.06)相比，miR-92a-3p組細胞中GPR124表達(0.21±0.03)顯著降低，與anti-miR-NC組(0.53±0.05)相比，anti-miR-92a-3p組(0.97±0.08)顯著升高(P<0.05),且4組比較差異有統計學意義(F=86.925，P=0.000)。

圖4 GPR124的3′UTR中含有與miR-92a-3p互補的核苷酸序列

3 討 論

DN、腎小球硬化、膜性腎病均可引起足細胞疾病，足細胞的變化在此過程中具有關鍵作用〔16〕。足細胞受損導致其從基底膜脫落，毛細血管袢塌陷，細胞外基質增多，最終血管袢受阻，引發腎臟疾病，因此足細胞數量的降低與DN的進程呈正相關〔17,18〕。在建立動物模型試驗中，高糖是常用的經典糖尿病誘發物。高燕等〔19〕、蘇寧等〔20〕運用鏈脲佐菌素建立DN模型，本研究用高糖30 mmol/L處理永生型小鼠足細胞48 h建立了高糖誘導的足細胞損傷模型，且模型構建成功。

有研究表明，miRNA對細胞的增殖、分化、凋亡具有重要作用，其可能參與人類的腎病、尿毒癥、DN等多種疾病的發生發展〔21,22〕。miR-223-3p在2型DN進展中具有重要作用，其可作為診斷DN的新型標志物〔23〕。詹學良等〔24〕研究報道，miR-92a的表達量與足細胞的損傷程度呈正相關，推測miR-92a可能參與腎臟細胞的損傷。楊竣〔25〕構建了穩定敲減miR-92a的主動脈內皮細胞，治療后可促進糖尿病大鼠勃起，上調內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和Dickkopf相關蛋白(DKK)3的表達，揭示miR-92a-inhibition可促進糖尿病大鼠的勃起。張成銀等〔26〕研究發現，miR-92a的表達與DN呈正相關，提示miR-92a參與DN的發展。本研究發現，miR-92a-3p高表達，且抑制miR-92a-3p可下調Desmin和細胞凋亡，保護足細胞損傷；深入研究發現，miR-92a-3p可靶向負調控GPR124。

GPR是一類受體超家族，其在機體的多種生理功能中具有重要作用〔27,28〕，其特征為受體結合配體后，僅能通過G蛋白轉導，再由第二信使將信號傳至效應器〔29〕。近年研究報道GPR在DN的進程中起關鍵作用〔30〕。GPR124為GPR家族的一種孤兒受體，其在轉化生長因子(TGF)-β通路、β-catenin通路中均具有重要作用〔31〕。王薪寧等〔32〕報道，GPR 119、40、120均可作為抗糖尿病藥物的作用靶點。陸楊等〔33〕研究報道，螺內酯可抑制DN大鼠中GPR激酶(GRK)2、GRK3、GRK4的表達，促進GRK6、GPR17的表達，提示螺內酯可調控DN大鼠GRKs和GPR17的表達。段倚琦〔34〕發現，GPR124在DN組細胞中低表達，且沉默GPR124可促進足細胞受損，過表達GPR124可通過增強細胞的自噬功能發揮保護足細胞的功能。本研究發現，GPR124低表達，進一步過表達GPR124發現，其可促進抑制Desmin的表達，下調細胞凋亡率；深入研究發現，敲減GPR124表達可逆轉抑制miR-92a-3p對高糖刺激小鼠足細胞損傷的保護作用。

綜上，miR-92a-3p可保護高糖誘導的小鼠足細胞損傷，其機制可能與靶向調控GPR124有關，為糖尿病腎病的靶向治療提供新靶點。