尿酸對果蠅嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力的影響

關(guān)寶生 張睿迪 白雪 王景濤 尹相林 王嘉淇 曹劉芳 王健宇 劉良辰 邱洪斌

(1佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2黑龍江省痛風(fēng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

高尿酸血癥(HUA)是由于體內(nèi)嘌呤代謝異常，導(dǎo)致血尿酸(SUA)生成過多和(或)排泄障礙而引起的一種代謝性疾病。中國大陸地區(qū)31個(gè)省、市、自治區(qū)成人的HUA患病率由1985年的15%左右上升至2017年的20%左右〔1〕。尿酸(UA)是人體重要的代謝產(chǎn)物，正常生理水平的UA是一種天然的抗氧化劑，具有多重抗氧化能力，能夠清除氧自由基和活性氧〔2,3〕。然而，當(dāng)機(jī)體UA水平持續(xù)升高，則會影響機(jī)體氧化-還原系統(tǒng)的平衡，表現(xiàn)出明顯的促氧化作用，能夠促進(jìn)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的其他自由基產(chǎn)生，誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，從而損傷細(xì)胞，并與高血脂、糖尿病、冠心病和腦卒中等眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切〔4〕。Xue等〔5〕隨機(jī)抽取58例輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)患者和57例健康老年人進(jìn)行微型精神狀態(tài)檢查，并觀測其體內(nèi)SUA水平與MCI發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；其研究結(jié)果顯示，MCI組UA水平顯著低于正常對照組，提示低水平SUA是MCI的危險(xiǎn)因素，適當(dāng)增加SUA水平可延緩MCI的發(fā)生和發(fā)展。果蠅是一種重要的模型生物，在神經(jīng)生物學(xué)研究方面具有重要的作用。本研究通過高嘌呤飲食構(gòu)建果蠅HUA模型，探討UA對果蠅嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1果蠅品系及飼養(yǎng)條件 選用W1118野生型黑腹果蠅，為佳木斯大學(xué)尿酸功能研究團(tuán)隊(duì)自有。果蠅均飼養(yǎng)在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度設(shè)為(25±0.5)℃，濕度設(shè)為(40±0.5)%、光照周期為12 h。果蠅飼養(yǎng)使用標(biāo)準(zhǔn)玉米粉培養(yǎng)基。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 腺嘌呤購于北京索萊寶生物科技有限公司；酵母購于英聯(lián)馬利(英國聯(lián)合食品集團(tuán))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 果蠅嗅覺行為測試設(shè)備購自蘇州卓凱生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，共設(shè)3個(gè)組別，對照組(標(biāo)準(zhǔn)玉米粉培養(yǎng)基)、低濃度干預(yù)組(腺嘌呤濃度為0.1%的培養(yǎng)基)、高濃度干預(yù)組(腺嘌呤濃度為0.3%的培養(yǎng)基)。收集羽化后的果蠅10 200只，每組3 400只果蠅，雌雄各半。

1.5果蠅體內(nèi)UA水平的測定 每組取25只果蠅并稱重，按重量(g)∶蒸餾水(ml)=1∶9的比例，用玻璃勻漿器制成組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA檢測果蠅體內(nèi)UA水平。

1.6果蠅嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)指標(biāo)的檢測

1.6.1嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力測試所需氣味的制備 0.15% 3-辛醇(OCT)：按照每100 ml石蠟油中溶解150 μl OCT配置。0.10% 4-甲基環(huán)己烷(MCH)：按照每100 ml石蠟油中溶解100 μl MCH配置。

1.6.2嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力的測定 每次取100只果蠅進(jìn)行嗅覺行為測試，在溫度(25±0.5)℃、濕度(70±0.5)%、620 nm紅光燈暗房的條件下，將上述兩種氣味接入自動嗅覺行為測試設(shè)備，其中一種氣味伴隨電擊，對果蠅嗅覺行為進(jìn)行干預(yù)后將果蠅放入T-Maze中間的空腔中，左右兩側(cè)接入相同氣體，觀察果蠅趨避有害因素的行為，隨后記錄選擇兩種氣味的果蠅數(shù)量。重復(fù)上述測試，更換另一種氣味伴隨電擊，并做好記錄。分別對雌雄性果蠅進(jìn)行測定，每個(gè)性別果蠅進(jìn)行8次行為測試，結(jié)果取平均值。最后計(jì)算果蠅行為反應(yīng)指數(shù)(PI)，指數(shù)為0表示沒有學(xué)習(xí)記憶能力，指數(shù)為正則表示有學(xué)習(xí)記憶能力，指數(shù)為負(fù)則表示結(jié)果無效。PI=(PIOCT+PIMCH)/2×100；PIOCT=(XMCH-XOCT)/X總；PIMCH=(XOCT-XMCH)/X總。X代表選擇每種氣味的果蠅數(shù)。

1.6.3應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測嗅覺相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 取培養(yǎng)7 d的果蠅，每組雌雄各20只，應(yīng)用Trizol法提取RNA，以RT-PCR法測定果蠅體內(nèi)Rugose(Rg)、鋅指蛋白輪狀體(Rn)和Tau嗅覺相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參基因，結(jié)果以目的基因的光密度/內(nèi)參基因的光密度表示，引物為正義：TGCTGCTCCACCATGCCATTAAG，反義：CTCCAGTTCCTCCACCTCTTCCT；Rn正義：GCCTTCGCCAACTCGTCGTATC，反義：TGTGCTTGGTCAGGTAGGTCTCC；Tau正義：ACAATGACAGCGGCGTGGATG，反義：GGTCTTGAGGAGCAAGCGGTTC；β-actin正義：GCATCCACGAGACCACCTACAAC，反義：AGCCACCGATCCAGACAGAGTAC。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1果蠅體內(nèi)UA水平 隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的升高，與對照組比較，各干預(yù)組果蠅體內(nèi)UA水平顯著升高(P<0.01)。各干預(yù)組組內(nèi)雌雄性果蠅體內(nèi)UA水平也存在明顯差異，低濃度干預(yù)組雄性果蠅體內(nèi)UA水平顯著高于雌性果蠅，但在高濃度干預(yù)組雌性果蠅體內(nèi)UA水平顯著高于雄性果蠅(P<0.01)。見表1。

表1 各組果蠅體內(nèi)UA水平

與對照組比較:1)P<0.01，與雌性果蠅比較:2)P<0.01

2.2UA對果蠅嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力的影響 隨著果蠅體內(nèi)UA水平的升高，與對照組比較，低濃度干預(yù)組雄性果蠅的嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力明顯升高(P<0.05)；高濃度干預(yù)組雄性果蠅的嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力較低濃度干預(yù)組略降低。雌性果蠅隨著體內(nèi)UA水平的升高其嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)明顯的降低趨勢，但與對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組果蠅嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力的變化

與對照組比較:1)P<0.05

2.3各組果蠅嗅覺相關(guān)基因的表達(dá) 與對照組比較，雄性果蠅低濃度干預(yù)組Rg、Rn基因的表達(dá)量有增高的趨勢，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高濃度干預(yù)組Rg、Rn基因的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與對照組比較，雄性果蠅低濃度干預(yù)組Tau基因的表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，高濃度干預(yù)組Tau基因的表達(dá)量卻顯著降低(P<0.05)。與對照組比較，雌性果蠅低濃度干預(yù)組Rg基因的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而高濃度干預(yù)組Rg基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。與對照組比較，雌性果蠅低濃度干預(yù)組Rn基因的表達(dá)量有增高的趨勢，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高濃度干預(yù)組Rn表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與對照組比較，雌性果蠅低濃度與高濃度干預(yù)組雌性果蠅Tau基因的表達(dá)變化不明顯(P>0.05)。見表3，圖1。

表3 各組果蠅Rg、Rn和Tau基因mRNA的表達(dá)

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

1 對照組(雌)，2 低濃度干預(yù)組(雌)，3 高濃度干預(yù)組(雌)，4 對照組(雄)，5 低濃度干預(yù)組(雄)，6 高濃度干預(yù)組(雄)圖1 各組Rg、Rn、Tau基因mRNA表達(dá)

3 討 論

本研究結(jié)果證明果蠅HUA模型建立成功。低濃度干預(yù)組雌性果蠅體內(nèi)的UA水平顯著低于雄性果蠅組，提示雌激素可能抑制了UA的生成和(或)促進(jìn)其排泄；而高濃度干預(yù)組雌性果蠅體內(nèi)的UA水平則顯著高于雄性果蠅組，提示雌激素的作用可能被抑制。

本研究顯示，提高雄性果蠅體內(nèi)UA水平可明顯促進(jìn)其嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力，但隨著UA水平的進(jìn)一步升高，則表現(xiàn)出一定的抑制作用。然而，雌性果蠅呈現(xiàn)完全不一樣的結(jié)果，UA不僅不能提高雌性果蠅的嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力，還表現(xiàn)出一定的抑制作用，推測可能與其體內(nèi)雌激素對UA代謝的影響有關(guān)。以上研究結(jié)果提示UA可能通過調(diào)控果蠅體內(nèi)嗅覺學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響其嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力。

Tau基因是一種果蠅的微管相關(guān)蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元軸突中〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)Tau蛋白激酶與磷酸酯酶功能失衡，引起Tau蛋白磷酸化的異常升高，打破其與微管結(jié)合的動態(tài)平衡，使Tau蛋白發(fā)生異常聚集、纖維化和神經(jīng)纖維纏結(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)元軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，并抑制乙酰膽堿釋放及蛋白酶體的活性，導(dǎo)致神經(jīng)元呈慢性進(jìn)行性變性〔7～13〕。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病與神經(jīng)元細(xì)胞中Tau的異常磷酸化和表皮生長因子受體(EGFR)信號相關(guān)〔14,15〕。果蠅中Rg是哺乳動物和人神經(jīng)信號蛋白(NBEA)的同源物，是一種與突觸處的神經(jīng)遞質(zhì)/內(nèi)膜囊泡運(yùn)輸有關(guān)的支架蛋白。有研究顯示，攜帶Rg突變體的果蠅表現(xiàn)出與人NBEA缺失所致自閉癥相似的學(xué)習(xí)缺陷和認(rèn)知障礙，并與EGFR和delta-notch通路的基因存在相互作用〔16～19〕。Rn在果蠅嗅感受器神經(jīng)元前體中表達(dá)，對其嗅覺系統(tǒng)發(fā)育的控制起至關(guān)重要的作用〔20〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，UA對雌性果蠅和雄性果蠅Rg、Rn和Tau基因mRNA的表達(dá)變化存在不同的影響，在雄性果蠅中，Rg和Rn基因mRNA的表達(dá)量隨著UA水平的升高而升高，而Tau基因mRNA的表達(dá)量卻呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。然而，在雌性果蠅中，Rg和Rn基因mRNA的表達(dá)量隨著UA水平的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，Tau基因mRNA的表達(dá)量幾無變化。本研究發(fā)現(xiàn)，UA可能不是通過調(diào)控果蠅體內(nèi)Rg和Rn基因表達(dá)而影響其嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力，或者也可能是因?yàn)榇萍に氐拇嬖谘谏w了UA對雌性果蠅嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力的影響。然而Tau基因的表達(dá)變化與果蠅嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力的變化趨勢基本一致，提示Tau在UA對果蠅嗅覺學(xué)習(xí)記憶能力的影響方面可能扮演著重要的角色。因此，下一步擬通過果蠅HUA模型進(jìn)一步探討UA對Tau基因的調(diào)控作用，揭示其機(jī)制，并驗(yàn)證雌激素對UA代謝的影響。