蟲草素聯合吉西他濱對乳腺癌細胞凋亡的影響及機制

樊華 朱永軍 趙永鋒

(山西中醫藥大學 1中醫臨床學院西外教研室，山西 太原 030001；2附屬醫院乳腺科)

乳腺癌治療主要以外科手術和化療為主〔1，2〕。吉西他濱常用于治療非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌等〔3～5〕。但由于其毒性和不良反應較多，且患者易出現耐藥性，導致化療藥物治療效果不佳。目前臨床治療癌癥已逐漸采用聯合用藥的治療方式，以期提高療效的同時減少化療藥物的耐藥性和對機體的毒副作用〔6〕。蟲草素是中藥冬蟲夏草的天然產物，具有廣泛的抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物學活性〔7〕。蟲草素作為抗腫瘤的中藥之一，在乳腺癌、肝癌、結直腸癌等多種腫瘤中表現出較強的抗腫瘤能力〔8～10〕。蟲草素在體外能夠阻滯腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。中藥聯合化療藥物的聯合用藥的方式已成為目前治療腫瘤的研究熱點〔11〕，本實驗采用中藥蟲草素聯合化療藥物吉西他濱作用于人乳腺癌MCF-7細胞，觀察對細胞、增殖、凋亡及細胞周期的影響，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7細胞株購于美國ATCC公司；蟲草素購于大連美侖生物技術有限公司，純度>98%；吉西他濱購于江蘇奧賽康藥業股份有限公司；RPMI1640培養基購于美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購于賽默飛世爾科技有限公司；膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于日本TaKaRa公司；噻唑藍(MTT)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；超敏電化學發光(ECL)試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；蛋白激酶B(Akt)信號通路激活劑胰島素樣生長因子(IGF)-1購于美國Gibco公司；活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase-3)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購于武漢艾美捷科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、Akt抗體、磷酸化(p)-Akt抗體購于美國Cell Signaling公司。

1.2乳腺癌細胞培養 將人乳腺癌MCF-7細胞在無菌操作條件下置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(含100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素)中，培養條件為37℃，5%CO2，飽和濕度，每隔2 d更換1次新鮮的培養液，待細胞生長匯合度至80%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2～3 d傳代1次。

1.3MTT法檢測MCF-7細胞增殖能力 人乳腺癌MCF-7細胞培養至對數生長期時，以0.25%的胰蛋白酶消化細胞，將細胞以5×105個/孔接種于96孔培養板中，置于37℃恒溫細胞培養箱中過夜培養。將細胞隨機分為4組，蟲草素組，加入含蟲草素濃度為0.8 g/L的培養液；吉西他濱組，加入含吉西他濱濃度為10 μmol/L的培養液；聯合用藥組，加入含0.8 g/L蟲草素和10 μmol/L吉西他濱的培養液；對照組，不含藥物的等量培養液。每組設置6個復孔，分別培養24、48、96 h后檢測細胞增殖抑制率，即在每孔細胞中添加20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液，于37℃培養箱中孵育4 h，除去上清液，再分別在每孔細胞中添加150 μl二甲基亞砜溶液，置于震蕩儀上，避光孵育10 min，待結晶物完全溶解后用全自動酶標儀在490 nm處檢測每孔細胞的吸光度值，計算每組細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=(1-實驗組/對照組)×100%，每組實驗重復3次取均值。

1.4流式細胞術檢測MCF-7細胞周期和細胞凋亡情況 取對數生長期的乳腺癌MCF-7細胞，將細胞濃度調整為5×105個/ml，分別按照1.3方法加入藥物處理各組細胞48 h后，分別收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用預冷的固定液重懸細胞，細胞固定后緩慢加入預冷的95%的乙醇，調整乙醇終濃度為75%，置冰上孵育30 min。然后分別加入1 ml終濃度為50 μg/ml的碘化丙啶(PI)和RNA酶，染色1 h后，以流式細胞儀檢測各組MCF-7細胞周期分布和細胞凋亡情況。

1.5Western印跡檢測MCF-7細胞中蛋白表達水平 乳腺癌MCF-7細胞經含蟲草素、吉西他濱、聯合用藥的培養液干預48 h后，用細胞刮收集細胞，將收集的細胞中加入預冷的裂解液，置冰上裂解，提取各組細胞中總蛋白，用BCA蛋白定量檢測試劑盒對所提取的蛋白進行濃度定量測定。各組蛋白樣品取等量蛋白(約50 μg)用12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，在含5%脫脂奶粉的封閉液中孵育4 h，4℃過夜孵育一抗(均為1∶1 000倍稀釋)，室溫孵育二抗(1∶3 000倍稀釋)2 h，ECL法檢測，凝膠成像儀掃描圖像，采用Image J圖像分析系統分析各條帶灰度值，以GAPDH為內參，相對灰度值表示MCF-7細胞蛋白表達水平。

1.6Akt信號通路激活劑對MCF-7細胞凋亡的影響 以終濃度為50 ng/ml的 Akt信號通路激活劑IGF-1作用于聯合用藥組MCF-7細胞，處理48 h后，以流式細胞術檢測細胞凋亡情況。方法同1.4。

1.7統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞增殖抑制情況率比較 與對照組比較，蟲草素組、吉西他濱組及聯合用藥組細胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)。與蟲草素組和吉西他濱組比，聯合用藥組細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率比較

與對照組比較:1)P<0.05；與聯合用藥組比較:2)P<0.05；下表同

2.2各組細胞凋亡情況比較 與對照組比較，蟲草素組、吉西他濱組及聯合用藥組細胞凋亡率明顯增加，細胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與蟲草素組和吉西他濱組比，聯合用藥組細胞凋亡率顯著增加，細胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

圖1 流式細胞術檢測各組MCF-7細胞凋亡率

2.3各組細胞周期 與對照組比較，蟲草素組、吉西他濱組及聯合用藥組G0～G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少(均P<0.05)，吉西他濱組和蟲草素組G2～M期細胞明顯增加(均P<0.05)。與蟲草素組和吉西他濱組比較，聯合用藥組G0～G1期細胞顯著增多，S期和G2～M期細胞顯著減少(均P<0.05)。見表3。

2.4各組Akt信號通路激活水平 與對照組比較，蟲草素組、吉西他濱組及聯合用藥組p-Akt蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。與蟲草素組和吉西他濱組比較，聯合用藥組p-Akt蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。各組Akt蛋白表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表4。

2.5激活MCF-7細胞中Akt信號通路可部分緩解細胞凋亡 與聯合用藥組比較，IGF-1+聯合用藥組細胞凋亡率明顯降低〔(53.13±4.24)%vs(33.24±3.57)%，P<0.05〕。見圖4。

圖2 Western印跡檢測各組Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達

組別凋亡率(%)Cleaved Caspase-3Bax對照組1.26±0.090.21±0.020.45±0.05蟲草素組25.84±1.181)2)0.61±0.051)2)0.96±0.101)2)吉西他濱組34.04±1.621)2)0.70±0.061)2)0.92±0.111)2)聯合用藥組51.67±2.951)1.26±1.331)1.77±0.191)

表3 各組細胞周期比率比較

圖3 Western印跡檢測Akt、p-Akt蛋白表達

組別Aktp-Akt對照組1.06±0.090.31±0.03蟲草素組1.05±0.080.19±0.021)2)吉西他濱組1.05±0.100.15±0.021)2)聯合用藥組1.02±0.090.02±0.011)

圖4 流式細胞術檢測MCF-7細胞凋亡率

3 討 論

隨著醫學的發展，開展了對乳腺癌的篩查和綜合治療，使得乳腺癌的死亡率有所降低，但并未取得較大改善。究其原因是乳腺癌極易發生轉移和侵襲，在對乳腺癌進行化療過程中患者易產生耐藥性，加之化療藥物的毒副作用較大，嚴重影響乳腺癌的治療和預后〔12〕。蟲草素能夠在體外呈濃度依賴性的誘導人腎癌ACHN細胞凋亡，抑制細胞增殖〔13〕。Yu等〔14〕研究顯示蟲草素處理非小細胞肺癌細胞后，經檢測發現蟲草素可將細胞周期阻滯在G0/G1期，上調p53、p21等的表達導致細胞損傷增加，并提高細胞凋亡率。都興范等〔15〕研究發現蟲草素對人乳腺癌細胞MCF-7具有一定的抑制增殖、誘導凋亡的作用。吉西他濱是一種新型的脫氧胞苷類似物，能夠有效抑制DNA修復和脫氧核苷酸的生成〔16〕。吉西他濱通過誘導腫瘤細胞的凋亡發揮抗癌作用〔17,18〕。本實驗結果顯示，蟲草素和吉西他濱單用藥時均能夠抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖，誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期處于G0～G1期，上調Cleaved Caspase-3和Bax蛋白水平。聯合用藥具有協同作用，可增強抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡的作用。這說明蟲草素和吉西他濱聯合用藥具有協同增效的作用。本實驗發現單用藥和聯合用藥組Akt蛋白磷酸化水平顯著降低，提示Akt信號通路的活化受到抑制。Akt信號通路在介導腫瘤的生長和發展中具有重要作用，Akt蛋白磷酸化能夠促進存活蛋白表達的上調，存活蛋白可抑制凋亡蛋白的表達，導致細胞凋亡受到抑制〔19,20〕。因此，Akt通路的活化能夠抑制腫瘤細胞的凋亡〔21〕。蟲草素能夠通過抑制Akt信號通路的激活同時激活p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路誘導人膠質瘤細胞凋亡〔22〕。Wang等〔23〕研究顯示，蟲草素通過抑制Akt信號通路上調Caspase蛋白活性誘發人急性單核細胞白血病細胞凋亡。Jing等〔24〕研究指出，吉西他濱能夠通過抑制Akt信號通路促進胰腺癌細胞中Bax蛋白的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達，激活Caspase-3和Caspase-9誘導細胞凋亡。天花粉蛋白通過調節磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途徑增強吉西他濱對非小細胞肺癌A549細胞毒性和凋亡誘導作用〔25〕。本實驗蟲草素和吉西他濱單用藥和聯合用藥處理人乳腺癌MCF-7細胞能夠抑制Akt信號通路的激活，提示二者及聯合用藥誘導MCF-7細胞凋亡與Akt信號通路的活化有關。為進一步研究藥物誘導MCF-7細胞凋亡的作用機制與Akt信號通路有關，本實驗在聯合用藥組MCF-7細胞中施加Akt信號通路激活劑IGF-1，經流式細胞術檢測發現，Akt信號通路激活劑IGF-1能夠部分緩解由聯合用藥導致的細胞凋亡。驗證了蟲草素聯合吉西他濱對乳腺癌細胞凋亡的誘發與Akt信號通路的活化有關。

綜上，蟲草素和吉西他濱聯合使用能夠有效抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡，具有協同增效的作用，其分子機制有Akt信號通路的活化有關。為蟲草素和吉西他濱聯合用藥的乳腺癌臨床治療提供一定的實驗基礎。