基于雙熒光素酶報告基因系統的人源SREBP1基因啟動子的活性研究

楊念，李琛，李洪亮，鄭燕，房樹華，汪選斌△，趙雅瑋△

脂代謝重新編程是腫瘤發生發展的重要機制之一。固醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）是含有bHLH-Zip 結構的轉錄因子［1］，可調控內源性膽固醇、脂肪酸、三酰甘油和磷脂合成所需酶的表達，以維持血脂動態平衡［2］。研究發現，SREBP1的過度表達與某些惡性腫瘤的發生發展密切相關，在脂肪酸合成活躍的組織器官，如肝臟［3］、乳腺［4］、前列腺［5］，其發生腫瘤之后的惡性程度與SREBP1的表達增加有關。本研究利用生物信息學預測、分析并構建SREBP1基因啟動子雙熒光素酶報告基因載體，以期為研究針對SREBP1靶點的天然活性抑制劑篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ、RPMI 1640 培養基、Opti-MEM 和lipofectamine 3 000 轉染試劑購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，DNA marker 和感受態細胞Trans1-T1購自北京全式金生物公司，KOD-Plus-Neo 購自日本TOYOBO 公司，Gibson Assembly Master Mix 購自美國NEB公司，細胞基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒和去內毒素質粒抽提試劑盒購自美國Omega公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司，新生牛血清購自杭州天杭四季青公司，人肝癌細胞系HepG2由湖北醫藥學院附屬人民醫院腫瘤中心中藥藥理實驗室保存，質粒pGL3-Basic 和pRL-SV40 由湖北醫藥學院郭興榮副教授惠贈，大黃素購自上海陶素生化公司（批號T2869），引物委托上海生工生物工程公司合成，序列測定委托武漢擎科創新生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 分析軟件 選取SREBP1（Ensembl：ENSG00000072310）基因起始密碼子上游5 000 bp 序列，利用在線軟件NNPP、Prometer SCAN、TSSG、TSSW 和Nsite 在默認條件下對SREBP1基因啟動子序列及其轉錄因子結合位點進行預測分析。 分別在CpGFinder、MethPrimer、MethPrimer 2.0 和CpGPlot 四個軟件上傳獲取的基因序列，按照默認條件進行CpG 島預測分析。將Cister 軟件閾值設置為0.1，對SREBP1基因順式元件進行預測，并得出相應結果。本研究使用的在線軟件見表1。

1.2.2 HepG2 細胞培養 HepG2 細胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養，根據細胞生長情況進行適當換液傳代。

1.2.3 pGL3-SREBP1-pro 啟動子載體構建 培養HepG2 細胞，按照試劑盒說明書抽提HepG2 細胞基因組。以基因組DNA 為模板，PCR 擴增SREBP1基因啟動子，擴增片斷約2 000 bp（引物序列見表2）。50 μL PCR 反應體系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL、KODPlus-Neo 1 μL、基因組DNA模板5 μL、ddH2O 28 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，63 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，35個循環；68 ℃延伸10 min。PCR產物電泳檢測，用DNA 凝膠回收試劑盒純化回收后，-20 ℃保存。用KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切質粒pGL3-Basic，50 μL 酶切反應體系：10×Buffer 5 μL、質粒5 μg、KpnⅠ0.5 μL、XhoⅠ0.5 μL、ddH2O補足至50 μL。37 ℃酶切1.5 h后終止反應，酶切產物用DNA凝膠試劑盒純化回收后，-20 ℃保存。Gibson Assembly 是一種基于雙鏈DNA 分子同源序進行無縫拼接的DNA 連接方式。其中克隆的DNA片段與預處理好的pGL3-Basic載體兩末端具有相互重疊的核酸序列，以保證DNA片段按正確的順序進行拼接，再將這些片段直接加入混合酶（T5核酸外切酶、DNA合成酶、DNA連接酶）中，一步完成無縫拼接，流程圖見圖1。連接體系為10 μL：載體2 μL，克隆片段2 μL，Gibson Assembly Mix 6 μL，50 ℃反應1 h。連接產物經轉化Trans1-T1 感受態細胞，挑陽性菌落接種于20 mL 氨芐抗性的LB 培養基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養過夜后，提取質粒進行酶切鑒定，測序正確后命名為pGL3-SREBP1-pro。

Tab.1 Bioinformatics online software used in this study表1 本研究使用的生物信息學在線軟件

Tab.2 The amplification primer of SREBP1 promoter表2 SREBP1基因啟動子擴增引物

1.2.4 雙熒光素酶報告基因的檢測 常規培養肝癌HepG2細胞，設置空載組（pGL3-Basic+pRL-SV40）、攜帶報告基因載體的對照組（pGL3-SREBP1-pro+pRL-SV40）及添加天然活性抑制劑大黃素組（大黃素+pGL3-SREBP1-pro+pRLSV40）。轉染前1 d 將5×105/mL 的HepG2 細胞接種至6 孔板培養過夜，第2 天細胞密度達70%～90%時，在轉染前約1 h換新鮮培養基，天然活性抑制劑大黃素組加入含大黃素的培養基（大黃素終濃度100 μmol/L）。按照Lipofectamine 3 000試劑盒要求配制轉染液，每孔加2.5 μg質粒（2 475 ng目的載體和25 ng 內參載體pRL-SV40）。室溫孵育轉染混合液5 min 后加入含有細胞的培養板培養24 h，用PBS 洗2 次，加入1×PLB（passive lysis buffer）室溫搖動培養板裂解15 min，取上清，13 000 r/min 離心15 s；在96 孔酶標板中加入50 μL LARⅡ試劑，再加入10 μL細胞裂解液上清，立即放入酶標儀混勻并讀取螢火蟲熒光酶活性讀數，隨后立刻向反應液中加入50 μL Stop & GoBuffer（螢火蟲熒光素酶終止液和海腎熒光素酶的底物）立即放入酶標儀混勻并讀取海腎熒光素酶活性讀數。每個實驗組重復3次，取平均值，每個樣品的螢火蟲熒光酶數值與海腎熒光素酶數值的比值即為熒光素酶表達強度。

1.3 統計學方法 應用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SREBP1生物信息分析

2.1.1SREBP1啟動子區特征序列及其轉錄因子結合位點預測結果 在SREBP1基因起始密碼子上游5 000 bp 序列，NNPP 和Prometer SCAN 兩個軟件均預測存在5 個啟動子特征序列，見表3。TSSG 結果顯示，有2 個轉錄因子結合位點，分別位于1 810 bp處和4 955 bp 處。TSSW 結果顯示，有3 個轉錄起始位點在1 838 bp、2 587 bp 和4 936 bp 處，2 555 bp 處有TATA 盒。Nsite 預測有17 個轉錄因子結合位點，見表4。

Tab.3 The analysis results of the NNPP and Prometer SCAN predicting SREBP1 promoter表3 NNPP和Prometer SCAN軟件預測SREBP1基因啟動子分析結果

2.1.2SREBP1基因CpG 島分析 CpGFinder、MethPrimer、MethPrimer 2.0 和CpGPlot4 個軟件預測SREBP1基因分別有1 個、4 個、3 個、2 個CpG 島，結果見表5。

2.1.3SREBP1可能的功能性順式元件 Cister軟件對SREBP1基因順式元件的預測結果見圖2。共有49 個可能的功能性順式元件，主要集中在SREBP1上游5′端約1 000～2 000 bp 和4 000～5 000 bp 的位置。

Fig.1 The flowchart of pGL3-SREBP1-pro vector constructed by Gibson Assembly圖1 Gibson Assembly構建pGL3-SREBP1-pro載體流程圖

Tab.4 The analysis results of the Nsite predicting SREBP1 transcription factor binding sites表4 Nsite軟件預測SREBP1基因轉錄因子結合位點分析結果

Tab.5 The prediction results of SREBP1 CpG Island表5 SREBP1基因CpG島預測結果

2.2SREBP1啟動子雙熒光素酶報告基因載體的構建結果 根據生物信息學的分析結果，發現SREBP1啟動子的轉錄結合位點，CpG 島及順式作用元件主要集中在前2 000 bp的位置，因此選取長度為2 036 bp的SREBP1啟動子開展后續試驗。以HepG2細胞基因組DNA為模板，擴增SREBP1的啟動子，擴增片斷約2 000 bp（圖3）。Gibson Assembly 拼接PCR 片斷和線性化pGL3-Basic 載體，構建pGL3-SREBP1-pro啟動子載體，pGL3-SREBP1-pro酶切鑒定結果見圖4。構建載體測序后證實序列與人源性SREBP1啟動子區序列相一致。

Fig.2 The prediction results of Cister to SREBP1 cis-element圖2 Cister對SREBP1基因順式元件的預測結果

2.3 大黃素對SREBP1啟動子雙熒光素酶報告基因轉錄活性的影響 結果顯示，3組間熒光素酶活性差異有統計學意義（n=3，F=488.647，P＜0.001），pGL3-SREBP1-pro組熒光素酶活性顯著高于pGL3-Basic 組（3.124 5±0.206 3vs.0.020 3±0.001 9，P＜0.001），所構建的SREBP1雙熒光素酶報告基因具有啟動子活性。大黃素給藥組熒光素酶活性（1.452 6±0.043 7）顯著低于pGL3-SREBP1-pro 組（P＜0.001），大黃素能明顯抑制SREBP1的轉錄活性。

Fig.3 The PCR product of SREBP1 promoter圖3 SREBP1啟動子PCR產物

Fig.4 The double enzyme cutting identification result of recombinant plasmid圖4 重組質粒雙酶切鑒定

3 討論

3.1 SREBP1是潛在的癌癥治療新靶點 脂代謝的改變是影響腫瘤生長、生存和對抗藥性治療的關鍵因素。腫瘤病人組織SREBP1 表達水平增高，SREBP1 所調節的脂肪生成基因轉錄激活。因此，SREBP1是理想的潛在癌癥治療靶點。

3.2 生物信息學方法是預測SREBP1啟動子的重要手段 啟動子是調控基因表達的重要組成部分，利用生物信息學軟件對啟動子進行分析和預測，可為后續研究指明方向。為搜尋啟動子區域，本研究分別采用5 種不同的啟動子分析軟件對SREBP1基因啟動子區域進行預測，結果發現該基因至少存在2個啟動子，且存在TATA 盒。雖然由于各預測軟件的原理不同可能導致預測結果有一定偏差，但基本可以確定啟動子存在于SREBP1基因的5′非編碼區上游。CpG島通常位于基因啟動子的核心序列和轉錄起始點附近。本研究應用在線軟件CpGFinder、MethPrimer、MethPrimer 2.0 和CpGPlot 在SREBP1上游啟動子區域2 000 bp的位置均發現CpG島。轉錄因子亦稱為反式作用因子，通過與順式作用元件（即轉錄因子結合位點）結合才能有效激活基因轉錄，啟動子調控元件的鑒定有助于尋找相應的轉錄因子。Cister 軟件分析出SREBP1基因啟動子轉錄區5 000 bp片段中有49個可能的功能性順式元件，因此后續構建系列截短熒光素酶表達載體時要充分參考此結果，不能中斷這些轉錄因子結合位點。本研究運用生物信息學預測SREBP1啟動子，有效地從基因組中查找已知及末知的轉錄調控元件，為研究基因的結構和功能提供了可靠依據。

3.3 雙熒光素酶報告基因可有效檢測SREBP1活性 雙熒光素酶報告基因是研究基因表達調控和基因工程的重要手段之一，熒光素酶的表達量與熒光的強度相關，可作為真核細胞中基因表達量及啟動子活性的測定手段。筆者根據SREBP1基因生物信息學分析得到的結果，采用新型無縫克隆技術Gibson Assembly 方法成功構建了SREBP1啟動子雙熒光素酶報告基因載體，此方法較傳統的酶切連接、同源重組方法更為高效、簡單、多變，提高了構建成功率，為進一步研究SREBP1基因啟動活性及轉錄調控元件、探討基因表達調控機制提供了實驗依據。

3.4SREBP1轉錄活性檢測為尋找腫瘤脂代謝新靶點提供技術平臺 目前，中藥、天然產物抗腫瘤己經成為國內外研究的熱點。已有研究表明，中藥能夠抑制腫瘤脂代謝和SREBP1轉錄活性［7］。利用SREBP1轉錄活性檢測，可為尋找腫瘤脂代謝新靶點提供技術平臺。同時，大黃素作為天然活性抑制劑抑制了SREBP1轉錄活性，與筆者前期發現的大黃素能夠抑制SREBP1mRNA 和蛋白水平表達的結論一致［6］，對相應的SREBP1天然抑制劑的開發和利用具有重要意義。