程序性壞死特異性抑制劑-1對呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的保護(hù)作用

杜學(xué)柯，荊忍，張韻希，葛萬運(yùn)

機(jī)械通氣是危重癥患者治療過程中重要的生命支持手段，使用不當(dāng)可誘發(fā)肺損傷，即呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）［1］。在細(xì)胞水平上，VILI 可以誘導(dǎo)壞死性細(xì)胞死亡（necroptosis）。程序性細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的一種方式，與機(jī)體先天免疫反應(yīng)，炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展等關(guān)系密切，比如細(xì)菌和病毒感染，或者動脈粥樣硬化等無菌損傷導(dǎo)致的炎性病變［2］。程序性壞死特異性抑制劑-1（programmed necrosis inhibitor -1，Nec-1）是一種能夠特異性抑制細(xì)胞程序性壞死的生物堿物質(zhì)［3］，而對于Nec-1 能否改善呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的程度，目前尚少見相關(guān)報道。本研究旨在探討程序性細(xì)胞壞死在VILI 中的作用及相關(guān)機(jī)制，并觀察Nec-1 在其中的影響，以期為臨床治療VILI提供新的思路與靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 清潔級雄性成年SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量240～260 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水和飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Nec-1購自美國Sigma 公司，1 mg Nec-1溶于0.04 mL二甲基亞砜（DMSO）中，加生理鹽水至0.5 mL 備用；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司；SYBR Green 實(shí)時定量PCR 試劑購自Roche 公司；DMSO 購自美國Amresco 公司；蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；TOPO 型小動物呼吸機(jī)購自美國KENT 公司；酶標(biāo)儀購自BIO-RAD 公司；PCR 擴(kuò)增儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與模型構(gòu)建 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為自主呼吸組（C組）、正常潮氣量（VT）組（N組）、高VT組（H組）和程序性壞死特異性抑制劑組（Nec-1 組），每組10 只。VILI模型構(gòu)建參考文獻(xiàn)［4］，大鼠麻醉固定后行氣管切開插管術(shù)。C組大鼠保持自主呼吸；N組、H組和Nec-1組大鼠經(jīng)股靜脈給予肌松藥，連接小動物呼吸機(jī)進(jìn)行雙肺機(jī)械通氣4 h。呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置分別為：N 組潮氣量8 mL/kg，H 組和Nec-1組潮氣量40 mL/kg，呼吸比1∶1，呼吸頻率80 次/min。Nec-1組在機(jī)械通氣開始時股靜脈給予Nec-1（1 mg/kg），其他機(jī)械通氣組大鼠經(jīng)股靜脈給予等體積DMSO。

1.3 肺泡灌洗液的收集及檢測 機(jī)械通氣4 h后處死大鼠，用冷的磷酸鹽緩沖液反復(fù)灌洗支氣管肺泡，并收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），采用血球儀對肺泡灌洗液中滲出的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)；按照蛋白定量試劑盒操作步驟說明書檢測肺泡灌洗液中總蛋白含量；ELISA 檢測肺泡灌洗液中炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1β和TNF-α含量。

1.4 肺組織濕/干質(zhì)量比值（W/D）計算 處死大鼠后取右肺下葉組織稱濕質(zhì)量（W），置于60 ℃烘干箱48 h后再稱干質(zhì)量（D），計算肺組織W/D。

1.5 肺組織病理學(xué)觀察 用手術(shù)器械分離肺組織，用濾紙把大鼠左肺組織表面的血跡清理干凈，放入10%多聚甲醛溶液固定液中24 h，石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，分別在10 倍和40 倍光鏡下觀察。觀察肺組織病理學(xué)改變，進(jìn)行損傷程度評分［5］，在鏡下根據(jù)肺組織切片評分標(biāo)準(zhǔn)：①肺泡充血；②出血；③白細(xì)胞滲出到肺泡腔或血管壁；④肺泡壁損傷，分別按照0～4 分（0 分，少量輕微損傷；1 分，輕度損傷；2分，中度損傷；3分，重度損傷；4分，嚴(yán)重?fù)p傷）進(jìn)行評分。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測肺組織受體相互作用蛋白1（RIPK1）、受體相互作用蛋白3（receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）p65 的mRNA 表達(dá) 取冷凍肺組織，用TRIzol提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR。引物序列：RIPK1，上游5′-CTTAAGCCCAAGTGCAGTCA-3′，下游5′-ATAGCCCAACAAGGAGGATG-3′；RIPK3，上游5′-CAGTGTTGGCTGGAAGAGAA-3′，下游5′-AGGCTCAGAACTCCAGCAAT-3′；NF-κB p65，上游5′-GATGGGACGACACCTCTACACATA-3′，下游5′ - CCCAAGAGTCGTCCAGGTCA- 3′；GAPDH 作為內(nèi)參，上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT - 3′；下 游 5′- CTTTAGGGTAGTGGTAGAAG-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量［4］。

1.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測RIPK1、RIPK3 和NF-κB p65的蛋白表達(dá) 采用RIPA組織裂解液與蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（體積比100∶1）提取肺組織總蛋白，4 ℃離心5 min，留取上清液并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取45 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（稀釋度：RIPK1為1∶1 000、RIPK3為1∶500 和NF-κB p65 為1∶2 000）孵育過夜，次日洗膜3 次，每次10 min；一抗孵育1 h，洗膜3次，每次10 min；采用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，ChemiDocTMMP 成像系統(tǒng)成像并進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 的灰度值比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，C 組、N 組和H 組各指標(biāo)對比用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)；H組和Nec-1組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BALF 中各檢測指標(biāo)比較 C 組和N 組大鼠BALF 中各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。H 組總細(xì)胞數(shù)、總蛋白和炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平較C 組和N 組明顯升高（P＜0.01）。與H 組相比，Nec-1組總細(xì)胞數(shù)、總蛋白和炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平下降（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of related indexes in alveolar lavage fluid between four groups表1 各組肺泡灌洗液中相關(guān)指標(biāo)的比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of related indexes in alveolar lavage fluid between four groups表1 各組肺泡灌洗液中相關(guān)指標(biāo)的比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；F為C組、N組、H組單因素方差比較結(jié)果，a與C組比較，b與N組比較，P＜0.05；t 為H組與Nec-1組比較結(jié)果，表2、3同

組別C組N組H組Nec-1組F t總細(xì)胞數(shù)（105/mL）0.38±0.07 0.45±0.11 2.14±0.35ab 1.24±0.30 213.251＊6.186＊總蛋白（g/L）1.09±0.17 1.19±0.24 2.25±0.33ab 1.66±0.32 63.631＊3.974＊IL-6（μg/L）1.88±0.37 1.98±0.38 4.28±0.49ab 2.51±0.28 106.849＊9.943＊IL-1β（ng/L）67.68±2.93 69.95±2.93 116.48±5.62ab 88.82±4.09 466.789＊12.587＊TNF-α（mg/L）0.57±0.11 0.52±0.06 1.41±0.12ab 0.89±0.08 238.832＊11.470＊

2.2 各組肺組織病理學(xué)改變 肺組織HE 染色顯示，C組和N組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡內(nèi)無明顯炎性細(xì)胞浸潤。與C 組和N 組相比，H 組大鼠肺泡內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺間隔增寬。與H 組相比，Nec-1 組肺組織損傷程度較顯著減輕，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，見圖1。

Fig.1 Comparison of HE staining results between four groups（×40）圖1 肺組織病理HE染色結(jié)果比較（×40）

2.3 各組肺組織W/D 及和肺組織病理學(xué)評分比較 C組和N組W/D和肺組織病理評分無統(tǒng)計學(xué)意義。H組大鼠肺組織W/D和肺組織病理評分較C組和N 組明顯增高（P＜0.01）。與H 組相比，Nec-1 組大鼠肺組織W/D和肺組織病理評分下降（P＜0.01），見表2。

2.4 各組肺組織RIPK1、RIPK3 和NF-κB p65 的mRNA 表達(dá)水平比較 C 組和N 組肺組織RIPK1、RIPK3和NF-κB p65的mRNA和蛋白相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與C 組和N 組相比，H 組RIPK1、RIPK3和NF-κB p65的mRNA和蛋白相對表達(dá)水平升高（P＜0.01）。與H 組相比，Nec-1 組肺組RIPK1、RIPK3和NF-κB p65的mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01），見圖2、表3。

Tab.2 Comparison of the lung tissue wet-to-dry ratio and histopathologic scoring between four groups表2 各組肺組織W/D及肺組織病理學(xué)評分比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of the lung tissue wet-to-dry ratio and histopathologic scoring between four groups表2 各組肺組織W/D及肺組織病理學(xué)評分比較（n=10，±s）

組別肺組織W/D 肺組織病理學(xué)評分（分）C組N組H組Nec-1組F t 4.89±0.50 4.99±0.82 7.94±0.80ab 6.21±0.52 57.983＊5.739＊2.41±0.23 2.49±0.31 4.89±0.35ab 3.85±0.44 221.208＊5.884＊

Fig.2 Expressions of related proteins in lung tissue in four groups圖2 各組肺組織相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

機(jī)械通氣可導(dǎo)致VILI，繼而可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）［6］。其機(jī)制主要是由于機(jī)械通氣導(dǎo)致的機(jī)械損傷和生物損傷共同影響的結(jié)果，異常的機(jī)械牽拉作用于肺組織內(nèi)，可激活相關(guān)信號傳導(dǎo)，引起炎癥介質(zhì)的釋放和細(xì)胞死亡的增加，導(dǎo)致肺部及全身的炎癥反應(yīng)［7］。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)過40 mL/kg 的潮氣量機(jī)械通氣后，過度機(jī)械牽張導(dǎo)致了線粒體自噬激活和線粒體DNA逃逸，機(jī)械通氣介導(dǎo)了VILI 的發(fā)生，提示細(xì)胞凋亡和自噬存在于VILI 的發(fā)病過程中；而程序性壞死是細(xì)胞死亡方式，這一調(diào)控途徑包含：RIPK1和RIPK3激酶相關(guān)作用形成壞死復(fù)合體，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，作為損傷相關(guān)的分子模式加重炎癥反應(yīng)的程度，影響炎癥消退［8］，但程序性壞死在VILI的發(fā)病過程中作用及其機(jī)制尚不清楚。

Tab.3 Comparison of related genes and proteins in lung tissue between four groups表3 各組肺組織相關(guān)基因和蛋白表達(dá)比較

Nec-1 可特異性抑制RIPK1，進(jìn)而抑制程序性壞死的發(fā)生。既往研究發(fā)現(xiàn)，Nec-1能促進(jìn)炎癥的消退，可能是炎癥性疾病潛在的治療性藥物，它不僅可以是程序性壞死的抑制劑，也可以促進(jìn)炎癥過程中性粒細(xì)胞的凋亡，從而影響炎癥消退［9］。研究證實(shí)，Nec-1能減少缺血/再灌注對臟器的損傷［10］；對脂多糖誘導(dǎo)肺損傷［11］和新生兒膿毒癥相關(guān)肺損傷具有保護(hù)作用［12］；也可減少膿毒癥相關(guān)的急性腎損傷［13］。本研究結(jié)果顯示，與自主呼吸組比較，高潮氣量組（40 mL/kg）BALF 中總細(xì)胞數(shù)、總蛋白和炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平增高，肺組織W/D 和肺組織病理學(xué)評分增高，肺組織內(nèi)RIPK1、RIPK3 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平上調(diào)，表明大鼠經(jīng)40 mL/kg 的潮氣量機(jī)械通氣4 h后，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁萎陷，肺泡內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺間隔增寬，機(jī)械通氣導(dǎo)致肺損傷，其損傷機(jī)制可能與RIPK1/RIPK3/NF-κB 信號傳導(dǎo)通路激活有關(guān)。另外，與高潮氣量組比較，Nec-1 組BALF 中總細(xì)胞數(shù)、總蛋白和炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低，肺組織W/D和肺組織病理學(xué)評分降低，肺組織內(nèi)RIPK1、RIPK3 mRNA 和蛋白表達(dá)下調(diào)，表明Nec-1 可以降低大鼠VILI 動物模型BALF 中總細(xì)胞數(shù)、總蛋白和炎性因子水平，減低肺組織的W/D和肺組織的病理學(xué)評分，降低高潮量導(dǎo)致的肺損傷，提示其可能與RIPK1/RIPK3/NF-κB 信號傳導(dǎo)通路的抑制有關(guān)。筆者推測在機(jī)械通氣肺損傷過程中Nec-1可通過抑制RIPK1和RIPK3的表達(dá)，抑制NF-κB的激活，從而減輕肺損傷的程度，對VILI具有一定保護(hù)作用。