羅丹明席夫堿熒光探針的合成及在Cu2+和Fe3+檢測中的應用

郭振麗，楊 楊，劉景林，許 良

（內蒙古民族大學 化學化工學院 內蒙古自治區天然產物化學及功能分子合成重點實驗室，內蒙古 通遼 028000）

Fe 和Cu 是構成蛋白、細胞色素和多種酶的基本元素，在新陳代謝中起著重要的作用［1］。這些離子的失衡會對人體健康造成很大的威脅，可導致各種嚴重的病變。Cu 的攝取異常會導致代謝紊亂和神經退行性疾病，如威爾遜病、帕金森病、阿爾茨海默癥以及門克斯綜合癥［2］。Fe 的缺乏會引起貧血、肝腎損害、心力衰竭和糖尿病等；而Fe 含量超標會導致組織炎癥、多器官的損傷［3］。雖然現代儀器分析手段可以很成熟地檢測環境中的金屬離子，但由于試樣處理步驟復雜繁瑣，不利于生物試樣中金屬離子的實時檢測。熒光探針技術以其簡便、高效的特點在離子檢測中具有明顯的優勢，而根據羅丹明母體設計的離子型熒光探針分子在化學分析和生命科學領域得到廣泛應用［4-6］。本課題組曾設計合成了多種羅丹明類熒光探針分子，實現了對Fe3+，Cu2+，Hg2+的高靈敏度識別和熒光響應［7-8］。

本工作將羅丹明酰肼與對溴苯甲醛進行縮合反應，得到羅丹明席夫堿探針分子（RBr），通過單晶衍射和核磁共振波譜對它的結構進行了表征，在體積比為1∶1 的乙腈/水溶液中，RBr 對Cu2+和Fe3+顯示出較強的吸收和熒光識別特性。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

羅丹明B、金屬硝酸鹽（Fe3+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+，Pb2+，Ag+）、硫酸亞鐵銨：分析純，天津天力化學試劑公司；對溴苯甲醛：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；80%（w）水合肼溶液：上海薩恩化學技術有限公司；乙腈：色譜純，上海國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為蒸餾水：北京屈臣氏食品飲料公司。羅丹明酰肼按照文獻［9］的方法合成。

1.2 主要儀器

BRUKER AV-500M 型核磁共振波譜儀、BRUKER Smart CCD Apex-Ⅱ型單晶X 射線衍射儀：德國布魯克公司；SHIMADZU IRTracer-100型紅外光譜儀：日本島津公司；JASCO FP-6500型熒光分光光度計：日本佳司科公司；普析TU-1901 型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；2F-20D 型暗箱式紫外分析儀：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 RBr 的合成與表征

稱取羅丹明酰肼（0.684 0 g，1.5 mmol）和對溴苯甲醛（0.277 5 g，1.5 mmol），溶解于50 mL 無水乙醇中，加熱回流12 h。反應結束后，冷卻至室溫，將反應液倒入飽和食鹽水中，經二氯甲烷萃取、干燥、濃縮后，用石油醚/乙酸乙酯柱層析分離提純，得到白色粉末狀的固體RBr，產率為74%。合成路線見式（1）。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ為8.69（s，1H），8.01（d，J=7.1 Hz，1H），7.60～7.46（m，2H），7.45～7.34（m，4H），7.15（d，J=7.2 Hz，1H），6.53（d，J=8.8 Hz，2H），6.46（d，J=2.0 Hz，2H），6.26（d，J=8.8，1.9 Hz，2H），3.34（q，J=7.0 Hz，8H），1.17（t，J=7.0 Hz，12H）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）：δ為164.96，153.20，151.59，148.93，145.93，134.43，133.42，131.44，129.38，128.86，128.34，128.01，123.93，123.70，123.38，107.97，106.01，97.83，66.12，44.32，12.61。IR（KBr）：ν=2 966，1 701，1 616，1 514，1 427，1 309，1 220，1 120，1 008，817 cm-1。單晶X 射線衍射經驗分子式：C35H35BrN4O2。

2 結果與討論

2.1 RBr 溶液的配制及測試條件

稱取RBr 0.006 g，用乙腈配制成1×10-3moL/L 的儲備液。測試前再將儲備液用乙腈/水（體積比為1∶1）溶液稀釋為1×10-5mol/L。分別配制1×10-2mol/L 的Fe2+，Fe3+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+，Pb2+，Ag+待測溶液。為確定RBr 與Cu2+和Fe3+結合的最佳檢測時間，進行了光譜時間掃描，發現RBr 溶液在15 min 后光譜強度基本不變。因此，選擇性和滴定測試均在混合15 min 后進行。

2.2 RBr 對離子的選擇性

RBr 加入不同離子后的吸收和熒光光譜變化見圖1。由圖1 可知，在RBr 溶液中分別加入上述待測金屬離子后，RBr 分子對大部分離子無識別，吸收光譜或熒光發射變化不明顯。當加入Cu2+后RBr 溶液由無色變為紫色，560 nm 處出現最大吸收峰；而加入Fe3+后探針溶液變為粉紅色，紫外光激發下溶液出現紅色熒光。RBr 溶液的最大吸收峰為565 nm，熒光發射峰為578 nm，其他離子加入受均無明顯變化。

為了考察RBr 在復雜條件下對Cu2+和Fe3+的識別能力，加入干擾離子和待測Cu2+和Fe3+前后，測定多種離子共存時的光譜強度變化，結果見圖2。由圖2a 可知，在共存離子中加入Cu2+后，探針的最大吸收峰強度迅速增強，說明其他共存離子對Cu2+的識別干擾較小。由圖2b 可知，加入Fe3+前后，探針溶液的熒光發射強度均增強，尤其是Fe3+與Hg2+共存時，熒光強度為單獨加入Fe3+時強度的2 倍，這說明探針對Fe3+熒光選擇性較高。

圖1 RBr 加入不同離子后的吸收光譜（a）、熒光光譜（b）和溶液顏色（c）變化Fig.1 Absorption(a)，fluorescence(b) and color(c) changes of RBr added with various cations.

圖2 RBr 中加入Cu2+（a）或Fe3+（b）及共存離子的光譜變化Fig.2 Spectral changes of RBr added with Cu2+(a)，Fe3+(b) and co-existing ions.

2.3 RBr 光譜滴定實驗

為了研究RBr與Cu2+或Fe3+結合的動力學過程，進行了吸光度滴定和熒光滴定實驗。RBr 與Cu2+或Fe3+的滴定關系見圖3。由圖3a 可知，隨著Cu2+濃度的增大，探針在559 nm 處的吸收強度增強，當溶液中Cu2+濃度達到8.2×10-6mol/L 時，吸收強度達到峰值。Cu2+濃度為1×10-6～8.2×10-6mol/L時，與吸收強度呈線性關系（y=0.006 4x+0.008 4，R2=0.996 1）。由圖3b 可知，隨著Fe3+濃度的增大，584 nm 處的熒光強度逐漸增強，Fe3+濃度在1×10-6～8.2×10-6mol/L 時，與熒光強度呈較好的線性關系（y=54.607x-44.136，R2=0.994 5）。

圖3 RBr 與Cu2+（a）或Fe3+（b）的熒光光譜滴定關系Fig.3 Spectral titration of RBr with increasing concentrations of Cu2+(a) and Fe3+(b).

2.4 RBr 對Cu2+或Fe3+的識別機理

按照Job’s Plot 法［10］，確定了探針與Cu2+和Fe3+之間的配位關系，結果見圖4。將RBr 和金屬離子的總濃度保持在1×10-4mol/L，逐漸增大金屬離子的濃度，測定最大吸收和發射峰值。由圖4可知，當溶液中Cu2+的濃度與總物質的濃度之比為0.5 時，RBr 與Cu2+的絡合物出現了最大吸光度值，這表明RBr 與Cu2+以1∶1 濃度比絡合。同樣，Fe3+的濃度與總物質的濃度之比為0.5 時，熒光發射強度出現最大值，絡合濃度比也為1∶1。

圖4 RBr 與Cu2+（a）或Fe3+（b）的配位關系Fig.4 Complexation between RBr-Cu2+(a) and RBr-Fe3+(b).

2.5 RBr-Cu2+紫外光照射測試

在RBr 溶液中加入過量的Cu2+后，分別在波長為254，365 nm 的紫外光源照射下進行測試。不同紫外光照射下的560 nm 處的吸收強度變化見圖5。由圖5 可知，隨著254 nm 紫外光照射時間的逐漸延長，RBr-Cu2+的吸收強度逐漸增強；RBr-Cu2+絡合物溶液在365 nm 紫外光照射下，吸收強度增大為初始值的2 倍。該絡合物對測定365 nm的紫外光強度靈敏度高于254 nm，該絡合物可用于戶外紫外線強度的測定。

2.6 RBr 的pH 測試

為了表征RBr 在不同pH 條件下對金屬離子的響應變化，分別選取559 nm 處的吸光度和584 nm處的熒光強度進行測試。不同pH 條件下的RBr 加入Cu2+或Fe3+前后光譜強度變化見圖6。

圖5 不同波長的紫外光照射下RBr-Cu2+溶液在560 nm 處的吸收強度變化Fig.5 Changes of absorbance intensity at 560 nm as a function of ultraviolet irradiation time.

由圖6 可知，當溶液pH 為4～10 時，RBr 溶液的吸光度值變化不明顯；加入Cu2+后，RBr 在pH 為7 時吸光度值達到最大。同樣，溶液的pH 為6～10 時，RBr 的熒光強度變化不大；加入Fe3+后，RBr 溶液的熒光強度逐漸升高，在pH 為7 時熒光強度達到最大值。因此，RBr 的最佳測定條件為pH=7。

圖6 不同pH 條件下RBr 加入Cu2+（a）或Fe3+（b）前后的光譜強度變化Fig.6 Spectral intensity changes of RBr added with Cu2+(a) and Fe3+(b) under different pH conditions.

3 結論

1）將羅丹明酰肼與對溴苯甲醛縮合制得RBr。

2）RBr 在乙腈/水（體積比為1∶1）溶液實現了對Cu2+的吸收識別及對Fe3+的熒光檢測，并表現出良好的抗干擾性。RBr 溶液的吸收和熒光強度與Cu2+和Fe3+的濃度呈較好的線性關系。

3）RBr-Cu2+溶液吸光度隨紫外光照射時間的延長而逐漸增強，該絡合物可用于戶外紫外線強度的測定。