海帶釩依賴溴過氧化物酶基因甄別和表達分析*

丁海燕，李曉捷，郭 栗，楊官品

(1.中國海洋大學教育部海洋遺傳育種重點實驗室，山東 青島 266003；2.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；3.國家海藻海參工程科學與技術研發中心 山東 煙臺 264003；4.海藻遺傳改良和高效栽培山東省重點實驗室，山東 煙臺 264003；5.山東東方海洋科技股份有限責任公司，山東 煙臺 264003；6.中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所，山東 青島 266003)

不等鞭毛總門的褐藻與后鞭毛生物(如動物和真菌)和植物(植物、綠藻和紅藻等)的進化存在平行性，兩類生物有相似的先天免疫機制和脅迫防御反應機制[1-3]。先天免疫機制不同于脅迫防御應答機制。防御機制可經受體引發對病原體的抵抗[4-5]。最近，在模式褐藻長襄水云基因組中就找到了防御有關的受體[6]。過氧化物爆發導致局部活性氧簇(Radical oxygen species,ROS)濃度急劇升高，是防御應答機制之一。這一機制在人[7]、植物[8]和褐藻[2]中都存在。病原體感染導致膜釋放十八碳(植物)和二十碳(動物)脂肪酸，用于合成氧脂素(Oxylipin)。海帶同時存在這兩類氧脂素生物合成途徑[9-14]。

海帶(Saccharinajaponica)屬于囊泡藻界，不等鞭毛總門，褐藻綱，海帶目，海帶科，海帶屬。上1920—1930年代日本引入中國栽培。海帶是孢子體世代和配子體世代交替型生活史，從幼嫩孢子體長為成熟孢子體的過程中面臨諸多環境脅迫。中國海帶栽培主要是“浮繩網藻體倒置避夏”栽培模式。海帶的生長區直接面對強紫外線、強陽光、高溫度和頻繁的光照和溫度波動，而藻體的梢部卻指向弱光、相對低溫的海底。海帶栽培集約化程度高，面積大，藻體密集，經常與動物養殖空間重疊。大尺度、大范圍的環境溫度波動和海水酸化，海水富營養化也逐步演變成不可忽略的環境影響因子。這些因素單獨或組合作用，導致海帶孢子體處于持續性的免疫和防御狀態。有報道稱L.digitata受環境刺激后可識別其細胞壁多糖的分解碎片，觸發局部過氧化物爆發[15-16]，防御相關基因的表達，釋放游離脂肪酸[17]、加強鹵素代謝[18]。

褐藻是唯一利用無機碘抵抗細胞外氧化脅迫的生物。碘合成可高效去除過氧化物爆發產生的過量過氧化氫和過氧根離子[19]。催化鹵素合成的釩依賴鹵素過氧化物酶(Vanadium-dependent halogenperoxidase,vHPO)是一類過氧化物酶，依其對鹵素離子催化效率的不同，分為釩依賴氯過氧化物酶(vCPO)、釩依賴溴過氧化物酶(vBPO)和釩依賴碘過氧化物酶(vIPO)三類。3種過氧化物酶中，vCPO只存在于陸地植物中，而另外兩種存在于海洋藻類，尤其是褐藻中。研究發現vBPO基因能催化碘離子與過氧化氫反應生成次碘酸，而次碘酸進一步將碘離子氧化為碘分子。反應過程為：I-+ H2O2→ HIO + OH-;HIO + I-+ H+→ I2+ H2O。

vBPO在海帶免疫應答和防御中發揮重要作用[2]。為弄清海帶vBPO基因的表達模式隨海帶生長發育的變化關系及其與藻體碘含量的關系，探究海帶在生長發育過程中免疫防御反應的變化，本研究通過轉錄組分析研究了正常栽培海帶不同生長發育時期vBPO基因的表達模式。

1 材料和方法

1.1 RNA提取和轉錄組測序

本研究所用的海帶孢子體為東方7號[20]，分別在4個發育時期，即薄嫩期(Mushroom stage)、厚成期(Adult stage)、成熟期(Mature stage)和衰老期(Aging stage)采集兩株，取其生長點組織，用無菌海水徹底清洗表面粘液后，在液氮中研磨成粉末，用除多糖多酚的RNA提取試劑盒提取RNA，溶于DEPC處理過的重蒸水，用NanoDrop測定濃度，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度和可能的基因組DNA污染。合格RNA迅速置于-80℃冰箱中保存。

用Oligo(dT)磁珠富集mRNA，片段化后用六堿基隨機引物合成第一鏈cDNA，然后用DNA polymerase I和RNase H合成第二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。末端修飾并加A尾后與測序接頭連接，再用AMPure XP beads選擇片段大小，PCR擴增，用AMPure XP beads純化PCR產物，富集150～200 bp的cDNA形成測序文庫。將文庫用Qubit2.0定量，稀釋至1.5 ng/μL，用Agilent 2100檢測片段大小，合格后用Q-PCR方法進行準確定量(文庫有效濃度>2nmol/L)，在Illumina HiSeq平臺上測序。

去除含接頭、不確定堿基比例大于0.1%、Q≤20堿基數≥50%的初始讀序(raw reads)獲得凈讀序(cleanreads)。將凈讀序用Trinity[21]進行拼接(k=25，最小kmer覆蓋度=2)。用 FPKM方法校正轉錄本豐度，消除序列長度和測序深度影響[21]，實現豐度標準化。

1.2 碘含量測定

與轉錄組測序用海帶孢子體同步采集4個生長時期的東方7號海帶孢子體，每時期3株，通風處曬干后用粉碎機粉碎成≤400目的顆粒，均勻混合后用NaNO2-尿素法測量碘的含量[22]。

1.3 海帶vBPO基因表達模式分析

海帶4個時期轉錄組測序獲得的組裝物(unigene，后續分析轉稱為基因)針對Nr數據庫進行注釋，根據注釋信息獲取海帶vBPO基因及其對應各時期的轉錄本豐度。利用OmicShare tools2.0(www.omicshare.com)繪制vBPO基因表達熱圖。

1.4 海帶vBPO分子系統學分析和結構域預測

從海帶4個生長發育時期的轉錄組分析數據中提取vBPO基因的序列，用Unipro UGENE軟件(http://www.x64bitdownload.com/download/t-64-bit-unipro-ugene-64-bit-download-jheuyjsm.html)獲得其開放閱讀框(openreadingframe,ORF)并推導其氨基酸序列。在NCBI蛋白質數據庫中下載不同物種的vBPO序列。將這些序列用MAFFT(http://www.softpedia.com/get/Science-CAD/MAFFT.shtml)進行對位分析，然后用MrBayes3.2(http://mrbayes.csit.fsu.edu/)構建分子系統樹。最后獲取的系統樹是1 000次重復計算的結果。為進一步確定海帶vBPO基因，用NCBI的CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)結構域預測工具對其進行了結構域的預測。

2 結果

2.1 海帶vBPO基因表達模式

海帶孢子體4個生長發育時期的轉錄組測序共獲得196 238 671條凈讀序，組裝成133 516條不重復基因(Unigene,以下改稱基因)。這些基因中，只有33.84%可針對NR數據庫進行功能注釋，19.25%針對SwissProt數據庫進行功能注釋，32.95%針對PFAM數據庫進行功能注釋，33.06%針對GO數據庫進行功能注釋。另外，可注釋的基因中，絕大部分是病毒、轉座子等先關蛋白。海帶是非模式物種，進化上與已知模式物種親緣關系較遠。這給我們基于基因的功能注釋理解海盜生長發育時期的生理學變化造成巨大困難。

幸運的是針對NR數據庫的功能注釋獲得59條可能編碼vBPO的基因(見表1)。因為海帶基因組序列碎片化嚴重，無參轉錄組分析可能使轉錄本組裝也碎片化，我們轉而將133 457個基因的平均豐度作為59個vBPO基因轉錄本豐度的參照。我們發現海帶vBPO基因轉錄本平均豐度是相應生長發育時期的9～19倍，平均13倍。這說明，vBPO基因在海帶孢子體生長發育過程中始終高表達，間接地反映出栽培海帶孢子體很可能持續性處于脅迫響應生理狀態。

海帶孢子體不同發育時期，59個vBPO基因表達模式不同(見圖1)。在薄嫩期、厚成期、成熟期和衰老期，這些基因的轉錄本豐度(表達量)存在顯著差異。相對而言，vBPO基因在成熟期和衰老期的表達模式更相似，而薄嫩期和厚成期更相似。海帶孢子體不同發育時期碘含量逐期增加，薄嫩期為(0.30±0.00)‰，厚成期為(0.38±0.07)‰，成熟期為(1.57±0.05)‰，衰老期為(2.32±0.09)‰。碘含量與vBPO基因平均表達量成正相關(相關系數0.974)。

表1 海帶不同生長發育時期vBPO基因的表達豐度和轉錄組分析組裝長度Table 1 The abundance and length of the kelp vBPO gene transcripts

續表1

注：基因轉錄本豐度用FPKM值表示；*，小數點位數原因，計為零。
Note:The abundance of genes are expressed as the FPKM value;*,due to

2.2 海帶vBPO分子系統學分析及結構域預測

表達模式分析是基于注釋信息進行的。為進一步證實這些組裝物是vBPO基因，我們將59個注釋為vBPO基因中包含完整開放閱讀框的4個vBPO基因(GenBank存取號：MH430667、MH430668、MH430669、MH430670)逆翻譯(推導)成氨基酸序列，從NCBI數據庫下載16個物種的28條vBPO氨基酸序列，用這些序列構建分子系統樹。分析發現海帶4條vBPO氨基酸序列與掌狀海帶的vBPO親緣關系近，與所有褐藻vBPO氨基酸序列聚在一起。說明這4條海帶vBPO基因確實是vBPO基因(見圖2)。

對4條海帶vBPO基因對應的氨基酸序列進行結構域預測，發現它們的結構域相同，第339～602位氨基酸組成PAP2_like蛋白結構域，具有組氨酸磷酸酶和釩依賴鹵素過氧化物酶催化活性基團，第418～426位的KWQVHRMLR序列、從第493～495位的SGH序列和從第575～584位的RSHLGVHWRMD的序列是釩結合位置(見圖2)。

(①Mushroom stage；②Adult stage；③Mature stage；④Aging stage。(A)vBPO基因表達豐度熱圖；(B)FPKM值≥10的vBPO基因表達豐度折線圖；(C)FPKM值≥1但<10的vBPO基因表達豐度折線圖；(D)FPKM值>0但<1的vBPO基因表達豐度折線圖。(A)The heatmap of kelpvBPOgenes;(B)The line chart of kelpvBPOgenes with FPKM values≥10;(C)The line chart of kelpvBPOgenes with FPKM values≥1 but <10;(D)The line chart of kelpvBPOgenes with FPKM values>0 but <1.)
圖1 海帶vBPO基因在四個發育時期的表達模式
Fig.1 The expression abundance heatmap of kelpvBPOgenes during its growth and development

圖2 從有完整開放閱讀框的海帶vBPO基因推導的氨基酸序列與其他物種vBPO的分子系統學關系(上)及結構域(下)Fig.2 Phylogenetic relationship of the deduced amino acid sequences from annotated kelp vBPO genes containing the whole open reading frame with those retrieved from GenBank(above)and their structural domain (below)

PAP2_like蛋白是組氨酸磷酸酶和釩依賴鹵素過氧化物酶等組成的酶超家族，有磷脂酸磷酸酶、磷酸酯磷酸酶、葡萄糖-6磷酸酶、葉綠體膜脂磷酰甘油磷酸酶B、釩依賴氯/溴過氧化物酶等亞家族，有些酶是跨膜蛋白。本研究中未發現海帶vBPO的跨膜區。Colin等發現第409～418位氨基酸和第475～492位氨基酸是釩結合區[23]。第409～418位氨基酸為KWQVHRMLRP，這一區域與海帶vBPO第418～427位氨基酸序列完全一致。結構域分析也證實注釋為海帶vBPO的基因確實是vBPO。

3 討論

本研究用轉錄組測序的方法分析了海帶孢子體包括薄嫩期、厚成期、成熟期和衰老期在內4個生長發育時期vBPO基因的表達模式，并通過分子系統學分析和結構域比較驗證了海帶的這些基因確實是vBPO基因；發現海帶vBPO基因轉錄本在4個發育時期的平均豐度是相應時期全部基因轉錄本的平均豐度的9～19倍，平均13倍，說明海帶天然免疫和防御應答機制之一的碘富集過程持續性處于活躍狀態；發現海帶vBPO基因的表達量與海帶孢子體碘含量呈正相關。這些認知對海帶抗病抗逆生理機制解析具有重要意義，是海帶抗病抗逆機制研究的新嘗試。

海帶基因組測序已經測序[24]。同源性搜索已在發表的海帶基因組中找到了豐富的vBPO基因拷貝。但是已發表的海帶基因組序列片段化嚴重，達不到參考基因組的程度，搜索結果只能說明海帶基因組存在豐富的vBPO基因。如果是有參轉錄組分析，我們就能了解不同基因的轉錄特征。但是，由于已發表基因組序列的局限性，我們可能遺漏有關基因?；谶@樣的考慮，我們選擇了無參轉錄組分析。分析過程中發現多數轉錄本組裝物不完整。這又可能影響平均表達豐度的計量。因此，參考基因組質量的海帶基因組序列對轉錄組分析具有重要的意義。然而，我們不得不等待高質量基因組序列的發表。值得慶幸的是已經有用實時單分子測序(三代測序)技術結合二代測序測定海帶孢子體基因組獲得參考基因組質量的海帶基因組序列的工作(個人了解)。這將為深入研究海帶抗病抗逆機制提供背景數據基礎。

多拷貝基因的表達調控效率是比較低的，海帶需要在不同脅迫條件、不同發育時期選擇不同拷貝基因的表達并協調這些基因的作用。海帶不同vBPO基因結構、它們的表達模式及其與生長發育時期和不同脅迫條件的關系為深入研究海帶多拷貝基因的系統表達提供了一個切入點。

海帶vBPO基因轉錄本相對豐度是與全部轉錄本平均豐度比較獲得的相對值。我們最初想選擇四個時期表達量基本恒定的基因群的平均表達量作為內參來確定vBPO基因的相對表達量，但這些基因的表達量只是相對恒定。與vBPO基因一樣，無參組裝獲得的這些基因的序列也存在不完整性。既然都不完整，且是在相同的分析條件下比較。我們選擇了全部組裝物的平均豐度做對照來確定vBPO基因的相對表達豐度。海帶基因的表達分析也可以參考其他物種選擇內參基因。基于相似的考慮，我們沒有這樣做。

需要特別強調的是，本研究的表達分析針對的是多拷貝基因?；蛐蛄懈叨认嗨?。在這樣的情況下，實時定量PCR方法很難設計引物來區分不同的基因拷貝。但基于測序的轉錄組分析可以克服這一限制，實現不同基因拷貝的區分。在方法上，本研究將為多拷貝基因的表達分析提供一種方法學借鑒。

4 結語

分子系統學和結構域分析證實轉錄組分析注釋的海帶vBPO基因確實是vBPO基因。海帶vBPO基因存在多個拷貝，在4個時期持續性選擇性地表達，且平均表達量遠高于總體基因平均表達量。這說明現行栽培模式下，海帶孢子體有可能處于持續性脅迫響應狀態，為解釋頻發的生理性病害提供了一種可能性。轉錄組分析組裝獲得多條vBPO基因序列，這與海帶基因組存在眾多vBPO基因拷貝對應，但這些基因的結構、表達模式及其與生長時期和脅迫環境間的關系尚需進一步研究。