干細胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog在人非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

王永芳 宋姍姍 張春芳 陳昊

(徐州醫(yī)科大學附屬連云港市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇 連云港 222002)

非小細胞肺癌(NSCLC)是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，以老年患者居多，約70%以上的患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時已出現(xiàn)局部進展或遠處轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機會，其5年生存率通常低于20%〔1〕。在我國，NSCLC 的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，其中鱗狀細胞癌和肺腺癌是其主要的組織學類型〔2〕。干細胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog基因位于染色體12p13.31上，在維持外胚層多能性、阻止向原始內(nèi)胚層分化中起重要作用，有研究表明Nanog在生殖細胞腫瘤中陽性表達，其表達上調(diào)能夠抑制鈣黏素的表達，可誘發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進腫瘤細胞的增殖和遷移〔3〕。此外，近年來多項研究發(fā)現(xiàn)Nanog在乳腺癌、食管癌、胃腸癌及腎癌等多種惡性腫瘤組織中表達增高，且與患者預后密切相關(guān)，提示其可能作為腫瘤生物學和預后的分子標志物〔4～7〕。本文擬分析干細胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog在人NSCLC中的表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為NSCLC的治療及預后提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集50例2014年2月至2017年6月在連云港市第一人民醫(yī)院NSCLC患者術(shù)中切除的新鮮組織，以其中30例癌旁組織(距癌組織≤3 cm)及正常肺組織(距癌組織>3 cm)作為對照組，每例標本取下后立即放入冷凍管經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊吲R床資料完整，確診前未接受任何形式放療、化療等輔助治療，術(shù)后經(jīng)病理明確診斷。患者年齡33～76歲，中位年齡61歲；男32例，女18例；鱗癌23例，腺癌27例；腫塊直徑1.5～10.0 cm，中位直徑3.5 cm；臨床TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期12例，Ⅲ期11例，Ⅳ期9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。

1.2主要試劑 Trizol RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；兔抗人Nanog單克隆抗體(濃縮液)購自美國Cell Signaling Technology公司，以1∶400倍稀釋；三合一抗原修復液、過氧化物酶阻斷劑、二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國DAKO公司。

1.3實時熒光定量PCR法檢測Nanog基因 取100 mg的凍存新鮮組織液氮下研磨，加入1 ml Trizol RNA提取試劑抽提組織中的總mRNA，操作嚴格按照說明書進行。紫外分光光度計檢測其濃度及A260/280比值。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將提取 RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆茫琋anog和內(nèi)參照GAPDH的引物序列Nanog正義：5′-TGTGGGCCTGAAGAAAACTATC-3′,反義：5′-GCTGTCCTGAATAAGCAGATCC-3′；GAPDH正義：5′-TGTACGCCAACACAGTGCTG-3′，反義：5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。采用SYBR Green染料法行qRT-PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣本均設(shè)3個復孔，并進行擴增曲線和熔解曲線檢測，數(shù)據(jù)分析采用相對定量的方法，取2-ΔΔCt值進行比較，其中ΔCT =目的基因CT平均值-管家基因CT平均值，ΔΔCT=ΔCT癌-ΔCT癌旁。

1.4免疫組化檢測Nanog蛋白 標本均用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，采用EnVision二步法應(yīng)用儀器Roche Bench Mark XT免疫組化自動染色儀行免疫組化染色。設(shè)陽性對照并用PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。Nanog陽性表達主要定位于細胞核中，陽性判讀使用半定量積分法〔8〕：光鏡(×200)下檢查組織中陽性細胞所占比例和著色強度，①陽性細胞染色比例<6%計0分；6%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；>75%計4分。②陽性細胞著色強度：無0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。將以上兩項得分相乘為最后評分，0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～7分為中陽性，8分及以上為強陽性。

1.5統(tǒng)計學方法 運用SPSS16.0軟件進行方差分析、t檢驗及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC、癌旁組織及正常肺組織中Nanog基因的表達情況 NSCLC組織中Nanog mRNA相對表達量(3.25±1.12)顯著高于癌旁(1.20±0.45)和正常肺組織(1.03±0.28，P<0.01)；而癌旁與正常肺組織差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2NSCLC、癌旁組織及正常肺組織中Nanog蛋白表達情況 Nanog蛋白的陽性染色為棕黃色顆粒，在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，但在細胞核中的表達強于細胞質(zhì)(圖1)。Nanog蛋白在NSCLC組織中的陽性表達率為48%(24/50)，以中度-強陽性為主；癌旁組織Nanog陽性表達2例，以弱陽性為主；正常肺組織中Nanog未見陽性表達；Nanog蛋白在NSCLC組織中的陽性表達顯著高于癌旁組織和正常肺組織(P<0.01)。

圖1 Nanog在肺鱗癌和肺腺癌中表達(EnVision法，×200)

2.3Nanog mRNA表達與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 NSCLC組織中，Nanog mRNA表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和病理類型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，與性別、年齡、腫瘤大小及臨床分期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 NSCLC患者臨床病理特征與腫瘤組織中Nanog mRNA表達的關(guān)系

3 討 論

Nanog基因?qū)儆贜K家族基因，2003年由Mitsui等〔9〕和Chambers等〔10〕同時發(fā)現(xiàn)并報道，是一種在原始生殖細胞、胚胎干細胞及囊胚內(nèi)細胞群中均有表達的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎干細胞和胚胎發(fā)育早期高表達，而在已分化的組織中降低或消失。Nanog基因是維持外胚層多能性，阻止胚胎干細胞分化為原始內(nèi)胚層的關(guān)鍵因子，將其敲除可導致胚胎干細胞向原始內(nèi)胚層分化。研究發(fā)現(xiàn)，Nanog除了在生殖細胞中表達外，也在多種實體腫瘤中表達，將Nanog基因敲除后，腫瘤的發(fā)展在一定程度上受到抑制，提示Nanog與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而究其機制，目前尚無確切的定論〔11〕。

肺癌干細胞是導致肺癌發(fā)生的原始細胞，CD133+細胞主要分布在分化較差的腫瘤組織中，隨分化程度增高而減少，具有強致瘤性，而CD133-細胞則缺乏這種潛力。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中Nanog可以抑制CD133+細胞向CD133-方向轉(zhuǎn)化，維持CD133+細胞自我更新等干細胞特征，其高表達的肺癌組織侵襲性和耐藥性增強，預后更差〔12〕。當去除Nanog時，可以降低腫瘤干細胞的比例，消除腫瘤干細胞侵襲并抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，減弱了球體形成的能力，阻斷了肺癌細胞的致瘤和轉(zhuǎn)移能力〔13〕。

研究報道，Nanog具有誘導鱗狀細胞癌形成的潛力，常在人鱗狀細胞癌中過表達，包括食管鱗癌、口腔鱗癌及皮膚鱗癌等，可能與Nanog上調(diào)Zeb1、Twist和miR-21等驅(qū)動因子，從而誘發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細胞特征相關(guān)〔4，18，19〕。此外，本研究結(jié)果表明合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低分化NSCLC組織中Nanog mRNA表達量升高，推測其原因可能為分化程度低的腫瘤細胞其表型和基因結(jié)構(gòu)與原始幼稚的干細胞相近，因此具有干細胞特征的腫瘤細胞數(shù)量也越多，惡性程度越高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力越強。Nanog的表達可維持干細胞低分化條件，并維持干細胞自我更新和增殖能力，這對于協(xié)助分化信號至關(guān)重要。雖然本研究中Nanog的表達與腫瘤大小和臨床分期沒有統(tǒng)計學意義，但是隨著腫瘤增大，Nanog的表達相對增高，TNM臨床分期越晚Nanog基因表達量越多，提示Nanog基因表達與腫瘤細胞的增殖及惡性程度密切相關(guān)，而這些均是腫瘤預后不良的相關(guān)因素。Zhao等〔20〕研究顯示，Nanog表達升高的患者總生存率和無病生存率較差，提示其可以作為新型腫瘤標志物來指導臨床治療和指示預后。此外，有研究表明，Nanog表達上調(diào)可以增強致瘤性，而抑制或消除Nanog則可阻滯腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Nanog的表達與腫瘤進展、轉(zhuǎn)移、抵抗治療及復發(fā)有關(guān)，且與患者的耐藥性和生存率差異呈正相關(guān)〔11〕。然而Nanog調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的具體作用機制仍不清楚，還有待在更大樣本中進一步證明。

綜上，Nanog在NSCLC發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮癌基因的作用，有望成為NSCLC診斷的分子標志物及治療的潛在靶點，為研究NSCLC發(fā)病機制提供了新思路。