一例雞源致病型大腸桿菌的分離鑒定

朱慶賀，王 爽，李文超，陳 曦，楊旭東，王觀悅，李 丹，史同瑞*

(1.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾161005；2.方正縣畜牧局，哈爾濱150800)

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)引起的各種急性或慢性疾病的總稱。不同品種及日齡的雞均可感染，尤其2～3周齡雛雞發病嚴重，病雞表現精神沉郁，腹瀉，關節有腫脹，氣囊炎等癥狀[1]。該病的發病率和死亡率高，暴發頻繁，嚴重影響養雞業的發展。因此，集約化雞群養殖中常常使用抗生素來預防大腸桿菌病的發生[2]，抗生素的大量不合理使用導致耐藥菌株的產生，為大腸桿菌病的防治增加了難度。本研究自集約化養殖場的蛋雞中分離鑒定了一株致病型大腸桿菌，同時通過藥敏試驗對分離菌株進行了敏感藥物篩選，以期為雞場大腸桿菌病的抗生素治療提供藥物指導，避免無效抗生素的濫用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集自黑龍江省拉哈鎮某蛋雞養殖場6月齡蛋雞，瀕死雞表現精神沉郁，腿部關節腫脹，排黃白色稀糞。死亡雞剖檢可見明顯的心臟纖維素沉積、包心包肝癥狀。

1.1.2 試劑與儀器 葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、尿素酶、吲哚、VP、MR、麥康凱、伊紅美藍瓊脂培養基等生化試劑，購自青島海博生物技術有限公司；藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Veriti96孔PCR儀購自美國Life ABI公司。

1.1.3 試驗動物 2周齡雌性SPF雛雞10只，購自哈爾濱維科生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養 無菌條件下取病死蛋雞的肝臟、脾臟，接種于營養瓊脂、麥康凱和伊紅美蘭瓊脂平板上，37 ℃ 條件下培養 24 h，再挑取菌落形態特征明顯的單菌落，劃線傳代培養，純化3代后觀察單菌落細菌菌落形態，并挑取單菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細菌形態。單個典型菌落接種普通肉湯增殖培養。

1.2.2 分離菌株生化試驗 通過糖發酵試驗、尿素酶試驗、VP 試驗、MR 試驗、吲哚試驗進行分離菌株生化特性檢測。

1.2.3 分離菌株的PCR擴增和測序 以增殖的菌液為模板，用細菌 16S rDNA 的通用引物(表1)進行 PCR 擴增。PCR 擴增體系為：模板 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，Premix 12.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 90 s，30 個循環；72 ℃終延伸 10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 分離菌株的同源性分析 將分離菌株的16S rDNA測序結果提交到GenBank中進行同源性比對，確定分離菌株的種屬。

1.2.5 動物致病性試驗 SPF雛雞致病性試驗：取SPF雛雞10 只，隨機分成 2 組，每組 5 只，試驗組分別用分離純化細菌肉湯進行頸部皮下注射，每只雛雞接種上述細菌 0.5 mL (大腸桿菌濃度為3.0 × 109CFU/mL)，對照組每只接種生理鹽水0.5 mL，觀察細菌致病性情況，雛雞死亡后剖檢，對死亡雛雞心臟、肝臟組織涂片染色鏡檢。

1.2.6 藥敏試驗 將稀釋好的菌液每個平板接種0.1 mL，用滅菌玻璃棒涂勻整個平板表面，用無菌鑷子取10種藥敏紙片貼于平板上，每個平板貼5張紙片，相隔不少于 3 cm，將上述平板置于37 ℃溫箱內培養，24 h 后觀察結果并測量各紙片周圍抑菌圈直徑(mm)，參照EUCAST歐盟藥敏試驗(2016)標準[3]進行結果判定。

2 結果與分析

2.1 培養特性 麥康凱培養基上菌落呈現小粉紅色；伊紅美蘭瓊脂培養基上菌落呈現黑色帶金屬光澤、邊緣整齊、光滑濕潤形態；在普通瓊脂培養基上呈灰白色、圓形、整齊、隆起的菌落。

2.2 染色鏡檢 分離菌株革蘭氏染色為陰性小桿菌，兩端鈍圓，與大腸桿菌染色特性相符。

2.3 生化試驗鑒定 分離菌株能發酵乳糖，發酵葡萄糖產酸產氣，發酵麥芽糖、甘露醇，吲哚試驗為陽性，VP 試驗為陰性，尿素酶陰性，MR試驗陽性，與大腸桿菌生化特性相符(表2)。

表2 生化試驗結果Table 2 Results of biochemical test

“+”表示陽性，“-”表示陰性，“?”表示產酸產氣
" +" means positive，" -" means negative，" ?" means acid producing gas

2.4 PCR鑒定 分離菌進行16S rDNA擴增，得到大小為1457 bp的目的片段(圖1)，與預期大小一致，目的片段送吉林庫美生物有限公司測序。

1.M.DL-2 000 Marker;2.陰性對照;3.分離菌;4.陽性對照1.M.DL-2 000 Marker;2.Negative control;3.Isolated bacteria;4.Positive control圖1 細菌16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 1 Results of bacterial 16S rDNA agarose gel electrophoresis

2.5 測序分析 16SrDNA測序結果進行BLAST比對分析，結果表明(表3)，分離菌16SrDNA測序片段與Genbank中已知10株大腸桿菌菌株的同源性均在99%以上，因此，確定分離菌株為大腸桿菌菌株。

表3 分離菌株序列同源性分析Table 3 Analysis of sequence homology of isolated strain

2.6 雛雞致病性試驗結果 SPF雛雞頸部皮下接種后 12 h 全部開始發病，出現明顯腹瀉癥狀，肛門周圍有污穢物，48 h內全部死亡。剖檢死亡雛雞發現氣管支氣管粘液增加(圖2 A)；雛雞少量心包積液，肝臟腫脹，有出血點及出血斑，質地變脆(圖2 B)；十二指腸出血(圖2 C)。雛雞的心臟和肝臟組織中均可見所接種的細菌(圖2 D，100 x)。

圖2 致病性試驗結果Fig 2 Results of attack test

2.7 藥敏試驗結果 對已鑒定出的大腸桿菌進行藥敏試驗，結果見表4。藥敏試驗結果顯示，本次分離鑒定出的大腸桿菌對丁胺卡那敏感性較高，多粘菌素次之。

表4 藥敏試驗結果Table 4 Results of Antimicrobial test susceptibility test

R表示耐藥，I表示中介，S表示敏感

3 討論與結論

通過細菌的形態學觀察、生化試驗考察以及PCR鑒定等，確定從死亡蛋雞中分離得到菌株為大腸桿菌，動物致病性試驗證實，分離菌株具有強致病性。藥敏試驗證實，分離菌株對青霉素、氟苯尼考、慶大霉素、阿莫西林、氧氟沙星、頭孢唑啉、紅霉素等臨床上常用多種抗生素耐藥，僅對丁胺卡那霉素和多粘菌素較為敏感。這一結果與已報道黑龍江地區鵝源大腸桿菌藥敏結果較為相似[4]，證明臨床中禽源大腸桿菌耐藥性情況非常嚴重，有必要通過藥敏試驗進行藥物篩選使用，根據藥敏試驗結果篩選最敏感的藥物和最合適的劑量，切忌盲目用藥，濫用藥，否則耐藥情況很可能進一步加重。

與國外相比，我國的大腸桿菌分離株存在著明顯的地域性和多樣性，致病型血清型數量較大，雞源致病型大腸桿菌血清型多集中在O1、O2、O78等型，鄧彥宏等在東北地區(黑龍江，吉林，遼寧)分離得到219株大腸桿菌，共鑒定了189個分離株的血清型，其中O1、O4、O78、O138、O107、O141檢出率較高，證明這些血清型為東北地區的流行優勢血清型[5]，本研究并未進行大腸桿菌的血清型檢測，但測序結果表明，分離株與O1血清型CLSC36 株同源性最高，為99.5%，這一結果與已報道流行大腸桿菌優勢血清型結果一致，說明O1型大腸桿菌在黑龍江地區存在流行，并且耐藥性較高，本研究中丁胺卡那霉素和多粘菌素對其較為敏感，此結果對黑龍江省雞源致病型大腸桿菌的防治有一定的參考意義。

大腸桿菌病的控制主要以預防為主，但如果出現發病，抗生素治療仍是目前最有效的治療方式。隨著蛋雞、肉雞集約化養殖的增加，飼喂抗生素進行預防和治療大腸桿菌病已成為集約化養殖過程中必不可少的程序[2]，不合理使用抗生素必然導致大量細菌產生耐藥[6]，為此獸醫主管部門已經提出了減量化使用抗生素的倡議。最為行之有效的辦法仍然是找到一種可以代替抗生素治療細菌性疾病的替代品。應用疫苗和生物制劑防控大腸桿菌病被認為是一種良好防控措施[7-8]。益生菌的發現也為耐藥菌治療提供了機會[9]。而中草藥及中藥復方制劑因其療效好、低殘留、不宜產生耐藥性的特點，成為近年來的研究熱點[10]，但目前上述方法仍不能完全取代抗生素的作用，因此，還應進一步探索研究，為真正做到抗生素減量化使用奠定基礎。