超高效液相色譜-串聯四級桿質譜法測定水產品中硝基呋喃類代謝物的方法改進

包永華，王璐璐

(1.浙江經貿職業技術學院，杭州 310018；2.浙江方圓檢測集團股份有限公司，杭州 310013)

硝基呋喃類藥物(呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林)是一類人工合成的具有硝基呋喃基本結構的廣譜抗生素，曾廣泛應用于水產養殖業，治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引起的腸炎、疥瘡、潰瘍等[1]。該類藥物及其代謝物具有潛在的致癌、致畸、致突變等毒副作用,因而引起人們的高度重視[2-3]。目前，全球大多數國家均將其列為禁用藥物，硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留是國際動物源性食品貿易的必檢項目[3]。有關水產品中硝基呋喃類代謝物的檢測方法，主要有酶聯免疫法(ELISA)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、液相色譜-紫外法[6]、液相色譜-質譜法(HPLC-MS)[7]、液相色譜-串聯質譜法((HPLC-MS/MS)[8]、超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)[9]等。UPLC-MS/MS法能夠充分發揮超高效液相色譜的高分離度、高分析速度與串聯質譜的高特異性和高靈敏度的優勢，成為檢測水產品硝基呋喃類代謝物的最常使用的技術路線。本研究以國家標準GB/T 20752-2006[10](豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法)中的實驗方法為基礎，對樣品前處理過程進行了優化，樣品衍生后乙酸乙酯直接提取，確保在能達到低檢出限要求的同時，控制回收率在90%～110%以內，RSD均小于10%。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 水產樣品(魚片、河蝦、明蝦、螃蟹)，購于杭州世紀聯華超市。試劑：呋喃它酮代謝物(AMOZ)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，10 mg/瓶，純度≥99.2%；呋喃西林代謝物(SEM)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，0.1 g/瓶，純度≥99.5%；呋喃妥因代謝物(AHD)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，0.1 g/瓶，純度≥99.38%；呋喃唑酮代謝物(AOZ)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，50 mg/瓶，純度≥98.2%；呋喃它酮代謝物的內標物(D5-AMOZ)，WITEGA，10 mg/瓶，純度≥99.10%；呋喃西林代謝物的內標物(13C15N-SEM)，WITEGA，10 mg/瓶，純度≥99%；呋喃妥因代謝物的內標物(13C3-AHD)，WITEGA，100 mg/瓶，純度≥99.10%；呋喃唑酮代謝物的內標物(D4-AOZ)，WITEGA，50 mg/瓶，純度≥99.80%；2-硝基苯甲醛(C7H5NO3)，含量≥99.0%；二甲基亞砜(C2H6OS)，含量≥99%；乙酸乙酯，德國Merck公司，含量≥99.8%，規格4 L；磷酸氫二鉀(K2HPO4)，含量≥98%；乙腈，德國Merck公司，含量99.9%，規格4 L。

1.2 儀器與設備 1290 Infinity高效液相色譜儀(Agilent Technologies公司)；QTRAP 5500 串聯四極桿質譜儀(AB SCIEX公司)超純水儀，美國Millipore公司；氮氣吹干儀；分析天平：感量0.1 mg；離心機：轉速4000 r/min以上。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：C18柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱溫:35 ℃；進樣量:10 μL；流動相及流速見表1。

1.3.2 質譜條件 離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：MRM；霧化氣GS1：55.0 psi；輔助加熱氣GS2：55.0 psi；氣簾氣CUR：35.0 psi；輔助氣溫度TEM：600 ℃；噴霧電壓IS：5500 V；入口電壓EP：10.0 V；碰撞池電壓CXP：12.0 V；碰撞氣CAD：MEDIUM。4種硝基呋喃類代謝物及其內標物質譜條件參數見表2。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

表2 質譜條件Tab 2 Condition of mass spectrometry

* 為定量離子

1.3.3 標準溶液的配制 將呋喃它酮代謝物(AMOZ)，呋喃西林代謝物(SEM)，呋喃妥因代謝物(AHD)，呋喃唑酮代謝物(AOZ)及其相對應的四種內標物分別配制成濃度為1 mg/L的標樣待用。

1.3.4 樣品預處理 取樣2 g，加入10 μL，濃度為1 mg/L的內標，20 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液，0.3 mL衍生劑，充分渦旋混勻后37 ℃恒溫振蕩水浴避光反應 16 h。衍生后加入5 mL磷酸氫二鉀，混勻后用氫氧化鈉溶液調節pH約為7.4。加入5 mL乙酸乙酯，充分振蕩后離心提取上清液，重復操作兩次，合并上清液，氮氣吹干，加入定溶液1 mL復溶后過0.22 μm濾膜，上機待測即可。

2 結果與分析

2.1 標樣質譜圖 根據GB/T 20752-2006標準中要求，呋喃它酮代謝物(AMOZ)，呋喃西林代謝物(SEM)，呋喃妥因代謝物(AHD)，呋喃唑酮代謝物(AOZ)檢出限為0.5 μg/kg。因此，按照改進步驟中的質量數，將配制好的標準溶液再次稀釋后分別適量加入空白樣的水產品中，使得四種硝基呋喃類代謝物標樣上機濃度為1 μg/L，經過改進的實驗方法處理后，進樣分析(圖1～圖8)。

圖1 呋喃它酮代謝物(AMOZ)定量及定性離子出峰質譜圖Fig 1 The mass-spectrogram of AMOZ

圖2 呋喃它酮代謝物的內標物(D5-AMOZ)出峰質譜圖Fig 2 The mass-spectrogram of internal-standard for AMOZ

圖3 呋喃西林代謝物(SEM)定量及定性離子出峰質譜圖Fig.3 The mass-spectrogram of SEM

圖5 呋喃妥因代謝物(AHD)定量及定性離子出峰質譜圖Fig.5 The mass-spectrogram of AHD

圖6 呋喃妥因代謝物的內標物(13C3-AHD)出峰質譜圖Fig.6 The mass-spectrogram of internal-standard for AHD

圖7 呋喃唑酮代謝物(AOZ)定量及定性離子出峰質譜圖Fig.7 The mass-spectrogram of AOZ

圖8 呋喃唑酮代謝物的內標物(D4-AOZ)出峰質譜Fig.8 The mass-spectrogram of internal-standard for AOZ

從圖1～圖8出峰質譜圖來看，呋喃它酮出峰時間在2.06 min，峰高最大值4.0 e5cps，D5-AMOZ內標出峰時間在2.02 min，峰高最大值3.1 e5cps；呋喃西林出峰時間在3.67 min，峰高最大值1.6 e5cps，13C15N-SEM內標出峰時間在3.66 min，峰高最大值1.9 e5cps；呋喃妥因出峰時間在3.87 min，峰高最大值1.6 e5cps，13C3-AHD內標出峰時間在3.86 min，峰高最大值2.85 e5cps；呋喃唑酮出峰時間在4.65 min，峰高最大值1.3 e6cps，D4-AOZ內標出峰時間在4.60 min，峰高最大值2.1 e6cps。由此可見水產品中的基質對硝基呋喃類代謝物的檢測并無干擾，出峰時間穩定峰型較為明顯。

2.2 回收率試驗 取上述陰性樣品，分別加入標準溶液，使得四種硝基呋喃類代謝物理論上機濃度分別為1、5、10、15、20 μg/L，按照樣品預處理方法進行處理，上機進樣分析后，結果如表3，由此可見，經過多次實驗表明，該改良版實驗步驟，能夠完全保證實驗數據的有效可行性，回收率控制在90%～120%之間。

表3 各目標物加標回收率Tab 3 The recovery rate of four nitrofuran metabolites

2.3 精密度試驗 取濃度為1 μg/L的基質標準溶液,重復進樣3次，結果(表4)表明，四種硝基呋喃類代謝物3次相應的RSD值均<10%，精密度良好。

表4 檢測方法精密度Tab 4 Precision of inspection method

2.4 實際樣品測定 為驗證方法的可靠性，從超市購買了多種類水產品(魚片、河蝦、明蝦、螃蟹)，根據改進后的方法進行測定。多數陰性樣品各離子譜圖較為干凈，沒有檢出。其中一明蝦樣品檢出含有呋喃西林代謝物(SEM)，該樣品在對應時間出峰明顯(圖9)，多次重復檢測后判定其為陽性樣品。

3 討論與結論

在硝基呋喃類代謝物殘留檢測時，固相萃取方法在樣品前處理的凈化方面具有明顯效果，可同時完成樣品的提取與凈化，大大提高檢測靈敏度。華正罡[11]等采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中硝基呋喃類藥物殘留，對陰離子交換混合機理柱(MAX)和親水-親脂平衡料固相萃取柱(HLB)的凈化效果進行考察，實驗結果表明，在 pH 7.2～7.4時 HLB 固相萃取柱回收率最高。王娜[12]等在高效液相色譜與質譜聯用法檢測豬肉中四種硝基呋喃類代謝物中，衍生溶液用Oasis HLB固相萃取柱凈化，甲醇洗脫，流動相定容，使用 Oasis HLB柱所得四硝基呋喃代謝物各自的平均回收率均在96.3% 以上。但是固相萃取方法也存在操作繁瑣、費時較多、需要耗費大量的有機溶劑等缺點。GB/T 20752-2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定》[10]中采用Oasis HLB固相萃取柱凈化，Oasis HLB 需要提前用甲醇和水活化，同時一定要保證柱體濕潤。另外，固相萃取對畜肉、禽肉等動物組織具有較好的提取凈化效果，但對基質比較復雜的水產樣品(魚、蝦、蟹和貝類)，樣品組織提取液呈黏稠、膠體狀，則易產生堵塞、不宜洗脫。因此，采用GB/T 20752-2006的方法處理樣品，效果并不好，因此，需要改進樣品的提取凈化方式。

圖9 陽性樣品SEM及其內標出峰譜圖Fig 9 The mass-spectrogram of SEM and its internal-standard for of Positive Sample

劉四新[13]等研究液相色譜串聯質譜法檢測水產品硝基呋喃類代謝物，對現行GB/T 20752-2006中的前處理中的樣品稱取量、水解和衍生化、凈化和定容試劑都進行了改進，其中在凈化環節采用乙酸乙酯液液萃取，改進后方法的回收率為81.3%～106.0%，相對標準偏差小于11%。吳亞梅[14]等就農業部783號公告-1-2006(簡稱方法1)和GB/T 20752-2006(簡稱方法2)兩種檢測方法進行對比研究，結果發現方法1采用乙酸乙酯提取的前處理方法簡單，檢測信號干擾少，檢出限、精密度和回收率優于方法 2，結果相對更準確可靠。在水產中硝基呋喃類代謝物檢測時，樣品經酸水解后衍生化，采用乙酸乙酯直接提取，氮吹后用流動相溶解殘留物，然后上機檢測。該方法操作簡單，提取液易揮干(約20 min)，無需固相萃取特殊裝置，成本較低，并且通過二級質譜的高選擇性，可以進一步排除雜質的干擾，結果也比較穩定。

在本文研究中，以國家標準GB/T 20752-2006的實驗方法為基礎，對樣品前處理過程進行了改進，樣品衍生后采用乙酸乙酯直接提取，操作步驟簡單方便。經過多次試驗，證明改進后方法的結果及穩定性可靠，四種代謝物回收率控制在90%～120%以內，RSD<10%，能夠達到標準要求的目標物檢出限，可適用于日常水產品中硝基呋喃代謝物的大批量樣品檢測工作。