中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物的檢測方法研究

高 婷，李應超，王亞芳，張連彥，張小飛，鐘昆芮

(北京市獸藥監察所，北京 102629)

酰胺醇類藥物，主要有氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考，其作為一種抑菌性廣譜抗生素，作用是抗感染，可作用于細菌核糖核蛋白體的 50S 亞基，而阻撓蛋白質的合成[1]。由于其價格低廉，可大量生產，因此有些不法商家將酰胺醇類藥物加入綠色、安全的中獸藥散劑中，以提高藥物抗菌作用。添加的化學藥物與中藥的相互作用既有可能減弱療效，又有可能對動物產生新毒副作用[2-3]。非法添加酰胺醇類藥物導致畜禽產品中藥物殘留，對人的造血系統、消化系統具有嚴重的毒性反應，有可能引發人的再生障礙性貧血[4-5]，因此急須建立一種穩定的、可靠的方法監測中獸藥散劑中酰胺醇類藥物的非法添加現象。

目前，中獸藥制劑中非法添加化學藥物分析檢測的技術手段主要有顯微鑒別[6]、薄層色譜分析[7]、高效液相色譜[8-9]、液質聯用技術[10]等。顯微鑒別方法能夠實現快速檢測,但該方法只能進行初步定性；薄層色譜分析也是起到初篩的作用，存在假陽性的風險；液質聯用技術—般不作為主要分析手段用于常量分析。高效液相色譜以分離性能高、分析速度快，通過保留時間及紫外圖譜雙重定性，減小了假陽性的可能性，因此，高效液相色譜不僅是獸藥檢驗的常用分析方法，也是檢查中獸藥制劑中非法添加化學藥物的最主要的分析手段。

實驗在上述文獻的基礎上，結合國家標準，對中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物進行研究，以滿足檢測需要。試樣經40%甲醇溶解、離心、定容，最后經高效液相色譜二極管陣列檢測器檢測。本方法快速、高效，能夠準確測定中獸藥散劑中非法添加的酰胺醇類藥物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國，配有二極管陣列檢測器)、電子天平(Mettler Toledo，瑞士)。甲醇、乙腈(色譜級，美國Fisher公司)，實驗用水由MilliQ-Gradient 超純水系統(美國Millipore公司)制備。

1.2 對照品 甲砜霉素對照品(來源：中國獸醫藥品監察所，批號K0241406，含量99.7%)、氟苯尼考對照品(來源：中國獸醫藥品監察所，批號K0301305，含量99.3%)、氯霉素對照品(來源：中國藥品生物制品檢定研究院，批號130555-201203，含量99.8%)。

1.3 供試品 健胃散、止痢散、球蟲散、胃腸活等中獸藥散劑均來自企業審批檢驗的合格產品。

1.4 色譜條件 色譜柱為Waters Atiantis?T3 5 μm,4.6 mm×250 mm。流動相A為甲醇；流動相B為乙腈；流動相C為水，梯度洗脫。流速1.0 mL/min；檢測波長為224和278 nm；進樣體積為10 μL。流動相梯度洗脫方法如表1所示。

表1 梯度洗脫方法Tab 1 The method of gradient elution

1.5 標準溶液的制備

1.5.1 對照品儲備溶液 分別精密稱取甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素對照品50、50、125 mg置100 mL量瓶中，加40%甲醇溶液超聲使溶解，用40%甲醇溶液稀釋至刻度，濃度分別為0.5、0.5、1.25 mg/mL，用時根據需要稀釋至相應濃度。

1.5.2 系統適用性溶液 精密稱取甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素對照品各25 mg，置50 mL量瓶中，加40%甲醇溶液適量，超聲使溶解，放置至室溫，加40%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加40%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濃度為50 μg/mL。

1.6 樣品溶液的制備

1．6.1 陰性樣品儲備溶液 分別稱取供試品0.50 g，精密加入50 mL 40%甲醇溶液超聲，6000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.6.2 陰性樣品溶液 精密量取陰性樣品儲備液1 mL，精密加入9 mL 40%甲醇溶液，混勻，上機前使用0.45 μm濾膜過濾。

1.6.3 陽性樣品溶液 精密量取陰性樣品儲備液1 mL，精密加入對照品儲備液1 mL和8 mL 40%甲醇溶液，混勻。上機前使用0.45 μm濾膜過濾。

1.6.4 陽性添加樣品 按照甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素制劑常用規格，即5%，5%，12.5%的比例在供試品中添加3種酰胺醇類藥物。

2 結果與分析

2.1 系統適用性試驗 取40%甲醇溶液、系統適用性溶液、陰性樣品溶液、陽性添加樣品溶液，在本試驗確定色譜條件下測定，記錄色譜峰，如圖1，圖2，圖3，圖4所示。在此測定條件下，40%甲醇溶液及各陰性樣品溶液對待測組分沒有干擾，各藥物之間的分離度良好，甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的出峰時間分別為9.1、18.7、24.2 min，各目標峰純度角小于純度閾值，表明峰的純度較好。

圖1 40%甲醇溶液色譜圖Fig 1 The chromatogram of 40% Methanol solution

圖2 酰胺醇類藥物對照品溶液(50 μg/mL)色譜圖Fig 2 The chromatogram of Amide alcohol reference solution (50 μg/mL)

圖3 健胃散-空白色譜圖Fig 3 The blank chromatogram of Jianweisan

圖4 健胃散-添加(50 μg/mL)色譜圖Fig 4 The chromatogram of Jianweisan-addition (50 μg/mL)

2.2 精密度試驗 取濃度為50 μg/mL的甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的混合標準溶液，在本試驗確定色譜條件下，連續進樣6次，其峰面積的RSD分別為0.11%、0.11%、0.13%，表明在該色譜條件下檢測，標準溶液精密度良好。

2.3 重現性試驗 按陽性添加樣品的制備方法制備6份健胃散添加溶液，在本試驗確定色譜條件下進樣，測定甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的峰面積，RSD分別為2.13%、2.56%、2.29%，表明此方法的重現性良好。

2.4 檢測限 精密量取各樣品的陰性樣品儲備液1 mL，置15 mL離心管中，精密加入系統適用性溶液適量(0.5 mL、0.6 mL和0.8 mL)，用40%甲醇溶液稀釋至10 mL，搖勻，在本試驗確定色譜條件下進樣，以光譜未失真的最低添加量作為檢測限。經對比光譜圖及純度峰，所檢測藥物中甲砜霉素的檢測限為3 g/kg、氟苯尼考及氯霉素的檢測限均為4 g/kg，如圖5至16所示。

圖5 甲砜霉素-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 5 The spectrum of Thiopentomycin-reference (50 μg/mL)

圖6 甲砜霉素-對照品(50 μg/mL)純度峰Fig 6 The purity peak of Thiamphenicol- reference (50 μg/mL)

圖7 氟苯尼考-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 7 The spectrum of Fluoroquinol -reference (50 μg/mL)

圖9 氯霉素-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 9 The spectrum of Chloramphenicol-reference (50 μg/mL)

圖10 氯霉素-對照品(50 μg/mL)純度峰Fig 10 The purity peak of Chloramphenicol-reference (50 μg/mL)

圖11 止痢散(甲砜霉素3 g/kg)光譜圖Fig 11 The spectrum of Zhili San (Memboxin 3 g/kg)

圖12 止痢散(甲砜霉素3 g/kg)純度峰Fig 12 The purity peak of Zhili San (Memboxin 3 g/kg)

圖13 止痢散(氟苯尼考4 g/kg)光譜圖Fig 13 The spectrum of Zhili San (Flufenicol 4 g/kg)

圖14 止痢散(氟苯尼考4 g/kg)純度峰Fig 14 The purity peak of Zhili San (Flufenicol 4 g/kg)

圖15 止痢散(氯霉素4 g/kg)光譜圖Fig 15 The spectrum of Zhili San (Chloramphenicol 4 g/kg)

圖16 止痢散(氯霉素4 g/kg)純度峰Fig 16 The purity peak of Zhili San (Chloramphenicol 4 g/kg)

2.5 標準曲線的繪制 精密量取甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的對照品儲備液，用40%甲醇稀釋至濃度分別為10、20、50、100、250、500 μg/mL，在本試驗的色譜條件下進行測定，以系列標準溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，三種藥物的線性方程分別為y=21.46x-7.1245；y=21.009x-4.1586；y=15.876x-3.5812，相關系數R2均在0.999以上，如圖17所示。結果表明，三種藥物在10～500 μg/mL濃度范圍內時，藥物濃度與相應峰面積線性關系良好。

2.6 加樣回收率試驗 在陰性樣品中按照80%，100%，120%添加甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素3種酰胺醇類藥物，按外標法計算其回收率，三種藥物的回收率在均在98.0%～103.0%，變異系數均在0.6%～1.6%，其試驗結果如表2所示。

圖17酰胺醇類藥物標準曲線方程與相關系數Fig 17 Standard curve equation and correlation coefficient of amide alcohols

表2 中獸藥散劑中添加酰胺醇類藥物(甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素)的回收率和變異系數(n=9)Tab 2 Recovery and coefficient of variation of amide alcohols (Methamphetamine,Florfenicol and Chloramphenicol)added to Chinese veterinary drug powder (n=9)

3 討論與結論

3.1 中獸藥散劑種類的選擇 一直以來，中獸藥具有綠色、安全、無殘留的特點，備受廣大養殖戶的青睞，寄托了獸醫獸藥行業的厚望。本試驗選擇的四種中獸藥散劑為養殖過程中的常用藥，均有一定的預防和治療腸道感染的作用。其中健胃散具有治療嘔吐反胃、消化不良的功效；止痢散具有治療濕熱瀉痢、熱毒血痢的功效；球蟲散具有抗球蟲病、涼血止血的功效；胃腸活具有治療消化不良的功效。酰胺醇類藥物，屬抑菌性廣譜抗生素，用于治療敏感細菌所致的呼吸系統、腸道及尿路等感染，故在畜禽養殖中極有可能被非法添加到上述四種中獸藥散劑中，用于加強預防及治療細菌感染。

3.2 色譜柱及柱溫的選擇 通過改變柱溫，未見色譜圖有明顯變化，考慮到本方法檢測較多樣品及采用梯度洗脫的方式，試驗選擇以35℃為檢測溫度，以提高色譜峰的重現性。本試驗使用了不同品牌、不同型號的色譜柱：Waters Atiantis?T3 (5 μm，4.6 mm×250 mm)、Waters symmetry C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)、Waters Xterra C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Agilent Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)等色譜柱，綜合考慮待測組分與其他藥物的分離度，以及保留時間和靈敏度，只有Waters Atiantis?T3(5 μm，4.6 mm×250 mm)對甲砜霉素保留時間較長，能使被測成分有效的分離，并且與其他成分峰不產生干擾。其他色譜柱不能使中獸藥制劑與三種酰胺醇類藥物有效的分離，或者不能將三種被測藥物有效的分離。

3.3 流動相的選擇 試驗在優化流動相的過程中盡量避免引入酸或鹽類物質，以免減少柱子壽命。本試驗探究了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水三種流動相組合，經比較甲醇-乙腈-水的分離效果比甲醇-水或乙腈-水的分離效果要好。由于中藥的成分比較復雜，等度洗脫未能完全實現藥物的基線分離，因此選擇梯度洗脫，洗脫程序為表1，其中甲砜霉素的極性最強，最先出峰，保留時間為9.3 min，氟苯尼考居中，保留時間為19.1 min，氯霉素的極性最弱，最后出峰，保留時間為24.2 min，此時三種酰胺醇類藥物能實現基線分離，并能與中獸藥制劑中的成分有效的分離。

3.4 結論 試驗采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器、梯度洗脫的方法，建立的中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物檢查方法，能夠實現添加的酰胺醇藥物與固體制劑藥物中其他成分的有效分離，經峰純度檢查確保酰胺醇類藥物出峰處無干擾，同時該方法較穩定、準確、重現性好，可用于中獸藥散劑中酰胺醇類藥物的檢測。此外，經試驗驗證，該方法對于β-內酰胺類、四環素類等固體藥物制劑中酰胺醇類非法添加的檢測也具有較好的效果。