國家標準方法測定水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測方法的改進

宋 瑞，李 云，趙義良，田 梅，王志恒，何立寧

(石家莊市畜產品質量監測中心，石家莊 050041)

硝基呋喃類藥物對大多數革蘭氏陽性菌和陰性菌、真菌、原蟲等病原體有很好殺滅作用，是一種廣譜抗生素。硝基呋喃類藥物常用的是以下4種:呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因。此4種藥物使用后在生物體內代謝迅速，其代謝產物分別為AMOZ、AOZ、SEM、AHD。因價格低且療效好，硝基呋喃類藥物廣泛應用于水產養殖業。但是，硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有致癌、致畸胎副作用。我國農業農村部已發布公告在飼養過程中禁止使用硝基呋喃類藥物[1]，且在動物性食品中不得檢出硝基呋喃類藥物代謝物。農業部783-1-2006號公告[2]實現了水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的檢測工作從無方法、無標準到有國家檢測方法的革新，并且能夠指導基層工作者進行這項檢測工作。其原理是將樣品肌肉組織殘留的硝基呋喃類代謝物在酸性條件下水解衍生化，經液液萃取后，氮氣吹干、甲醇溶液溶解，內標法定量。由于其中部分檢測過程不完善，會產生水解衍生化不徹底，液液萃取離心后，分層明顯，保留層較渾濁。氮氣吹干后，由于有油脂存在，渦旋離心后會產生嚴重乳化現象，使得標準曲線線性不理想。通過改變衍生化環境、調節離心轉速以及定容后渦旋轉速，較好的解決了上述問題，獲得較好的標準曲線。做2.5 ng/g陽性添加后，回收率可以達到95%以上。檢測的靈敏度可達0.1 ng/g。方法改進后提升了準確度、精密度、靈敏度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 AB SCIEX 5500超高效液相色譜串聯質譜儀；ZORBAX SB C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)色譜柱；甲醇為色譜純；鹽酸為優級純；磷酸氫二鉀為分析純；2-硝基苯甲醛(購自德國CNW公司)；標準品AMOZ(WITEGA公司，純度99.9%，批號C010MGNF003)、AOZ(WITEGA公司，純度99.1%，批號C010MGNF005)、SEM(Dr.公司，純度99.8%，批號G151417)、AHD(Dr.公司，純度99.3%，批號G138075)；同位素內標標準品AHD-13C3(WITEGA公司，純度99.1%，批號957509-21-8)、AOZ-D4(WITEGA公司，純度99.2%，批號1188331-23-8)、AMOZ-D5(WITEGA公司，純度99.6%，批號1017793-94-0)、SCA-HCI-13C,15N2(WITEGA公司，純度99.8%，批號1173020-16-0)。

1.2 試劑配制 5 mmol乙酸銨溶液0.385 g醋酸銨定溶于1000 mL水中,冰乙酸調節pH值至4.5；5%甲醇溶液：甲醇+水=5+95(V/V)；0.2 mol/L鹽酸溶液：濃鹽酸1.6 mL，用水稀釋至100 mL；0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：稱取0.0378 g 2-硝基苯甲醛，溶于5 mL 二甲亞砜中，現用現配；1 mol/L磷酸氫二鉀溶液：三水磷酸氫二鉀114.11 g，溶于500 mL水中[3]。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件 流動相：A相(5 mmol乙酸銨溶液，pH=4.5)+B相(0.1%甲酸乙腈)，流速：0.30 mL/min[4]，梯度如表1所示。

表1 流動相梯度Tab 1 Flow phase gradient

1.3.2 質譜條件 離子源：ESI源，正離子模式；IS電壓：5500 V；氣簾氣CUR：20 psi；霧化氣GSI：50 psi；輔助氣GS2：60 psi；源溫度TEM：550 ℃；碰撞氣CAD：9 psi，4種硝基呋喃代謝物及其內標的定性、定量離子對、同位素化合物碎裂電壓、碰撞能量如表2、表3所示。

表2 4種硝基呋喃代謝物的定性、定量離子對、同位素化合物碎裂電壓、碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pairs, fracture voltage and collision energy of 4 nitrofuran metabolites

表3 4種硝基呋喃代謝物內標的定性、定量離子對、同位素化合物碎裂電壓、碰撞能量Tab 3 Qualitative and quantitative ion pairs,fracture voltage and collision energy of 4 nitrofuran metabolites

1.4 實驗方法

1.4.1 標準曲線的配制 分別準確移取10 ng/mL 混合標準工作溶液0.025、0.05、0.10 mL和100 ng/mL混合標準工作溶液0.025、0.05、0.10 mL于50 mL離心管中，除不加樣品外，按提取與凈化步驟進行操作[5]。

1.4.2 樣品制備、提取與凈化 試樣制備，檢測樣品為市場監督抽檢鯉魚一尾(被抽樣單位佳農市場，產地行唐縣)，去鱗、去皮，切下脊背肉。磨碎[6]，勻漿，作為檢測試樣，同時也當空白試樣，多稱取2份樣品，加入適宜的標準溶液，作為陽性添加試樣[7]。

稱取試樣2.0 g，置于50 mL的離心管中，加入50 μL(100 ng/mL的混合內標工作液)。渦旋混合[8]50 s，加入5 mL鹽酸溶液和0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋50 s，37度恒溫振蕩16 h。取出離心管后放置至室溫[9]，加入4 mL濃度為1 mol/L的磷酸氫二鉀溶液，調節pH=7.0～7.5，(此處pH都在范圍內，不用調)，加入4 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩50 s，10000 r/min離心5 min。取上清液轉移至另一15 mL離心管中[10](分4層，取最上層)；再加入4 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩50 s，10000 r/min離心5 min，合并有機相，40 ℃下氮氣吹干。準確加入1 mL甲醇溶液[11]，使用IKA渦旋混合儀，渦旋速度低于500 r/min,15 s,取上清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定[12]。

2 結果與分析

2.1 衍生化過程 783號公告酸性環境用0.6 mL濃鹽酸加入100 mL水中，再加入2-硝基苯甲醛。實驗發現衍生化效果并不好，回收率較低，標準曲線線性不好。主要原因是濃鹽酸量較少。濃鹽酸使用量增大至1.6 mL[13]，回收率有明顯的提升。由圖1可見提升濃鹽酸濃度后，標準曲線線性得到明顯改善。衍生化后的pH值經比對，783號公告pH=1.18±0.02，方法改進后pH=0.95±0.02。

783號公告:0.6 mL濃鹽酸加入100 mL水中，衍生化回收率的重復性不好，造成標準曲線的線性不太好，結果如圖2～圖4所示。

圖1 AOZ定量離子標準曲線y=0.05530 x(r=0.96985)Fig 1 AOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.05530 x(r=0.96985)

圖2 AHD定量離子標準曲線y=0.04788 x (r=0.98370)Fig 2 AHD Quantitative Ion Standard Curvey=0.04788 x (r=0.98370)

圖3 SEM定量離子標準曲線y=0.05071 x (r=0.97434)Fig 3 SEM Quantitative Ion Standard Curvey=0.05071 x (r=0.97434)

圖4 AMOZ定量離子標準曲線y=0.05995 x (r=0.16883)Fig 4 AMOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.05995 x (r=0.16883)

方法改進后，1.6 mL濃鹽酸加入100 mL水中衍生化回收率的重復性明顯改善，得到的標準曲線線性很好，結果如圖5～圖8所示。

圖6 AHD定量離子標準曲線y=0.17715 x (r=0.99977)Fig 6 AHD Quantitative Ion Standard Curvey=0.17715 x (r=0.99977)

圖7 SEM定量離子標準曲線y=0.28517 x (r=0.99989)Fig 7 SEM Quantitative Ion Standard Curvey=0.28517 x (r=0.99989)

圖8 AMOZ定量離子標準曲線y=0.18027 x (r=0.99995)Fig 8 AMOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.18027 x (r=0.99995)

2.2 提取過程 磷酸氫二鉀溶液，783號公告為87.1g磷酸氫二鉀溶于500 mL水中。通常所用的磷酸氫二鉀為三水化合物，折完水應為114.11 g[14]。

2.3 離心過程 783號公告顯示離心轉速為4000 r/min，實驗發現此轉速離心后，上層液較渾濁，將轉速提升至10000 r/min時，可以很好的分層，上清液較澄明(圖9、圖10)。

圖9 離心轉速為4000 r/min上層液體Fig 9 Centrifugal speed 4000 r/min upper liquid

圖10 離心轉速為10000 r/min上層液體Fig 10 Centrifugal speed 4000 r/min upper liquid

2.4 定容過程 氮氣吹干乙酸乙酯后，783號公告使用甲醇溶液溶解，渦旋振蕩殘留物，實驗發現由于油脂的存在，渦旋振蕩殘留物會發生嚴重的乳化現象。氮氣吹干后加入1 mL正己烷除酯[15]，再加入甲醇溶液，渦旋10000 r/min離心10 min，離心后發現正己烷與甲醇溶液仍然發生乳化現象。氮氣吹干乙酸乙酯后[16]，使用甲醇溶液溶解將渦旋速度限定在500 r/min以下，15 s,短時間緩慢渦動,不僅能很好的溶解殘留物，同時避免油脂乳化。經檢測并不影響回收率。

2.5 檢測方法改進后回收率情況 由于783號公告所得標準曲線上的點分布較亂，改進后的方法標準曲線線性較好，可作為回收率計算的基礎。通過如上衍生化過程、提取過程、離心過程、定容過程的改進，平行樣品的陽性添加濃度為2.5 ng/g，稱取2 g，上儀器濃度應為5 ng/mL。4種硝基呋喃代謝物的回收率在95%以上，標準偏差小于10%，回收率有明顯的提升(圖11～圖15)。

圖11 空白樣品圖譜Fig 11 Map of blank samples

圖12 AOZ陽性添加樣品圖譜Fig 12 Map of AOZ positive samples added

圖13 AHD陽性添加樣品圖譜Fig 13 Map of AHD positive samples added

圖14 SEM陽性添加樣品圖譜Fig 14 Map of SEM positive samples added

圖15 AMOZ陽性添加樣品圖譜Fig 15 Map of AMOZ positive samples added

2.6 檢測的靈敏度 國家標準783-1-2006號公告中檢測限為0.25 ng/g，使用改進后的方法，最低檢出限可以達到0.1 ng/g。在空白的鯉魚樣品中加入適量標準溶液使之含有0.1 ng/g的4種硝基呋喃代謝物，稱取2 g，上儀器濃度應為0.2 ng/mL。按照改進后的前處理方法進行前處理，可以得到信噪比大于3，回收率在80%～120%之間，標準偏差小于10%的檢測結果(圖16～圖20)。

圖16 空白樣品圖譜Fig 16 Map of blank samples

圖17 0.1 ng/g AOZ添加樣品圖譜Fig 17 0.1 ng/g AOZ Add sample map

圖18 0.1 ng/g AHD添加樣品圖譜Fig 18 0.1 ng/g AHD Add sample map

圖19 0.1 ng/g SEM添加樣品圖譜Fig 19 0.1 ng/g SEM Add sample map

圖20 0.1 ng/g AMOZ添加樣品圖譜Fig 20 0.1 ng/g AMOZ Add sample map

3 討論與結論

農業部783-1-2006號公告，實現了水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的檢測工作從無方法、無標準到有國家檢測方法的革新，并且能夠指導基層工作者進行這項檢測工作。雖然本方法有很好的實用性，但在工作中也發現本方法存在回收率不高、重復性不好、基質效應較大等缺點。因此，在實際工作中通過不斷對本方法進行研究與摸索，進一步對本方法進行了優化和改進，通過對以上論述整理與總結，本研究總共從以下幾個方面對農業部783-1-2006號公告進行了優化：(1)進一步優化了水解衍生化酸性條件，加大了酸的濃度，提升了衍生化效率，提高了回收率，標準曲線線性得到明顯改善；(2)根據提取過程實際市售磷酸氫二鉀為三水化合物的情況，改進磷酸氫二鉀的使用量，使得磷酸氫二鉀的用量更加準確；(3)離心過程提升離心速度，使得上層液體更加澄清，分離效果更好；(4)本方法定容過程中限制甲醇溶液渦旋溶解速度，減輕乳化現象，使得前處理過程的凈化效果更好，降低了儀器的基質效應。有的方法是進一步用正己烷除脂，然后高速離心，但是這樣做也會造成乳化現象，導致分層不明顯，進而導致回收率降低，因此，兩相比較，本方法的凈化效果和回收率更好；(5)做2.5 ng/g陽性添加后，回收率可以達到95%以上，提高了方法的回收率；(6)檢測的靈敏度可達0.1 ng/g。將改進方法用于實際樣品和標準樣品的測定，提升了方法的準確度、精密度和靈敏度。綜上所述，通過對國家標準783-1-2006號公告的進一步優化，大大提高了方法的實際應用效果，對于更好的做好硝基呋喃類藥物及其代謝物的殘留檢測工作具有很好的現實意義。