苦蕎麥總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島素信號轉導通路中GSK-3β、AKt相關基因與蛋白表達的影響

遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種發病率極高的代謝性疾病，已嚴重影響人類生活。據國際糖尿病聯盟(the International Diabetes Federation，IDF)發布的第八版全球糖尿病地圖數據顯示，2017年全球共有4.25億糖尿病患者，其中中國患病人數最多[1]，90%～95%為2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)[2]。T2DM的病理機制與胰島β細胞功能失常和胰島素抵抗關系十分密切，其在環境、遺傳等因素的影響下通常表現為胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)[3]。糖原合成激酶-3β(Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是胰島素受體信號轉導通路中一個關鍵節點，它在細胞中過度表達會引起胰島素信號轉導受阻，引起IR[4-7]，有實驗表明抑制GSK-3β活性可改善小鼠的糖耐量水平，使肝糖原代謝增加進而增加肝糖原含量[8]。在胰島素信號轉導通路中，激活的蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT)可使GSK-3β磷酸化從而失活達到降血糖的目的。因此，促進Akt表達從而抑制GSK-3β可以減輕胰島素抵抗，改善糖耐量水平，產生潛在的抗糖尿病效果[9]。

苦蕎麥作為一種藥食兩用的植物，在國內外被廣泛種植[10]。其黃酮類化合物在醫藥保健方面具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力及保護心腦血管等多種功效[11-12]。研究通過觀察苦蕎麥總黃酮對Ⅱ型糖尿病胰島素信號轉導通路中GSK-3β和Akt基因與蛋白的表達情況的影響，測定各組大鼠肝組織中mRNA與蛋白含量，探討苦蕎麥總黃酮對Ⅱ型糖尿病影響的作用與機制。

1 實驗材料

1.1 動物與飼料 SPF級wistar大鼠78只，雄性，許可證號SCXK(遼)2015-0001 遼寧長生生物技術有限公司。高脂飼料和普通飼料(沈陽市于洪區前民動物實驗飼料廠)；豬油和蔗糖(沈陽市和平區金味源食品批發部)。

1.2 藥品與試劑 苦蕎麥總黃酮(日本三益制藥株式會社，含量為991.65 mg/g)；二甲雙胍(批號：20150617，沈陽維康醫藥連鎖有限公司)；鏈脲佐菌素(批號:1122F032，solarbio)；胰島素ELISA試劑盒；氯仿、異丙醇、無水乙醇(20150607)國藥集團化學試劑有限公司；RT-PCR試劑盒(AK5701)，核酸Marker(A801A)，上、下游引物(CHPA194)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號：20151222，Solarbio)；NC膜(批號：T426062，Pall)；TBS緩沖劑(批號：60900120)、蛋白ladder(批號：69J00157)購自北京鼎國公司；SDS-PAGE電泳粉(批號：20161111)、BCA蛋白含量檢測試劑盒(批號：20160629)購自凱基生物；蛋白提取試劑盒(批號：20160622)，GSK-3β(批號：0003)、Akt(批號：0020)、GAPDH(批號：0010)均為CST公司；HRP標記抗兔二抗(批號：0026，CST公司)。

1.3 儀器 ACCU-CHEK血糖儀(羅氏診斷產品有限公司)；ACCU-CHEK血糖試紙(羅氏診斷產品有限公司)；iMark酶標儀(美國BD)；JD500-3電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)；DW-HL388超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)；HR/T20M臺式高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；HE-90水平電泳槽、VE-180垂直電泳槽均為上海天能科技有限公司；S1000 Thermal Cycler梯度PCR儀(BIO-RAD)；Chemi XR5凝膠成像分析儀；化學發光儀。

2 方法

2.1 試劑配制

2.1.1 鏈脲佐菌素(STZ)注射液 將檸檬酸(2.585 g)、檸檬酸三鈉(2.265 g)用150 mL三蒸水溶解，用HCL調pH至4.2后用三蒸水定容至200 mL，4℃儲存。使用時加STZ配成濃度為2%STZ溶液，注意用濾膜除菌。

2.1.2 Western blot緩沖液的配制

2.1.2.1 TBS存儲液 粉劑常溫存放，使用時直接用純水稀釋成1 L的存儲液。

2.1.2.2 TBST洗液 由1L TBS存儲液加入0.5 mL吐溫混勻制成。

2.1.2.3 轉膜液 配轉膜液由粉劑在配液時加熱，并用純水定容至800 mL，再加200 mL甲醇混勻而成。

2.1.2.4 封閉液 封閉液濃度為5%，即用5 g奶粉加100 mL純水制成。

2.2 動物模型建立 雄性wistar大鼠于動物實驗中心適應性喂養(豬油及蔗糖)3 d后，隨機分為兩組：對照組(普通飼料)7只，高脂飼料組(高脂飼料)71只(分籠飼養，每籠7只)，喂養8周。喂養8周后，高脂飼料組按體質量篩選出成為食源性肥胖的大鼠(標準：高脂飼料組個體質量≥對照組個體質量均值+2倍標準差)后，繼續喂養4周。空腹狀態下用氧化酶法測定各組大鼠血糖；同時眶靜脈取血，用ELISA法檢測胰島素水平。計算胰島素敏感指數(ISI)=1/(FINSxFBG)(FINS為空腹胰島素，FPG為空腹血糖)。將對照組與高脂飼料組進行對照，篩選建立高脂飼料組大鼠胰島素抵抗模型。建模后對高脂飼料組大鼠進行連續2周腹腔注射鏈脲佐菌素，劑量為25 mg/kg·周。再次測量空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L視為造糖尿病模型造模成功[13-14]。

2.3 動物分組 除對照組外，將糖尿病造模成功大鼠隨機分5組，分別為模型組7只；4個用藥組分別為苦蕎麥總黃酮低劑量組7只(用藥量50 mg/kg)；苦蕎麥總黃酮中劑量組7只(用藥量100 mg/kg)；苦蕎麥總黃酮高劑量組7只(用藥量200 mg/kg)；西藥組7只(二甲雙胍100 mg/kg)。灌胃給藥4周后，再次眶靜脈取血后處死各組大鼠，提取肝組織。

2.4 指標測定及方法 給予高脂飼料8周后測量大鼠體重;給予大鼠注射STZ前，用ELISA法和氧化酶法分別測量大鼠的胰島素和血糖水平，并計算胰島素抵抗指數。具體方法：準備96孔加樣板，試劑盒室溫平衡30 min后，將樣品和標準品、生物素標記二抗和酶標試劑，置于37℃水浴中反應60 min；洗板5次，加入試劑盒中顯色液A 50 μL和B 50 μL，37℃水浴中反應10 min；加入終止液50 μL后于10 min內放入酶標儀450 nm波長下讀取OD值并計算;給予注射STZ 2周后用ELISA法測胰島素水平和血糖水平，并計算胰島素抵抗指數。方法同前。

2.4.1 RT-PCR法檢測大鼠肝組織中GSK-3β、Akt的mRNA表達情況

2.4.1.1 分離RNA 于冰盤上取100 mg大鼠肝組織，用預冷生理鹽水沖洗后剪碎，放入勻漿器內，加入1 mL Trizol試劑勻漿裂解細胞。靜止5 min后，轉移裂解液到EP管中，加入0.2 mL氯仿，劇烈搖動混勻。4℃靜置5 min后、12 000 rpm離心15 min。用移液器將水相轉移到新管中，加入等體積異丙醇混勻，靜置10 min。再次4℃、12 000 rpm離心10 min。去上清，加入1 mL 75%乙醇混勻，靜置5 min。第3次4℃、1 2000 rpm離心5 min。分離出RNA，倒掉乙醇，靜置5 min后加入30 μL DEPC水溶解，得到RNA溶液。取12 μL RNA溶液，加入 DEPC 水稀釋，用酶標儀測定260 nm 和280 nm的吸光度，并計算RNA的濃度和純度。

2.4.1.2 反轉錄出mRNA 按TAKARA試劑盒說明書要求配制10 μL反轉錄體系，于PCR儀中42～60℃條件下放置15～30 min，95℃條件下5 min，5℃條件下5 min；再配制PCR反應液40 μL，把此反應液加入到反轉錄反應結束的PCR反應管中，輕輕混勻，離心約10 s，進行PCR反應：94℃進行30sec，55～65℃進行30sec，上述兩步驟重復30Cycles，然后72℃進行50sec。準備上樣。在上述RT-PCR過程中用到的上、下游引物及合成序列長度如下：GSK-3β的上游引物序列為5′-TCGTCCATCGATGTGTGGTC-3′，下游引物序列為5′-TTGTCCAGGGGTGAGCTTTG-3′，合成長度為202bp，退火溫度為60℃；Akt的上游引物序列為5′- AGAGAGCCGAGTCCTACAGAATA-3′，下游引物序列為5′-CCGAGAGAGGTGGAAAAACA-3′，合成長度為133bp，退火溫度為61℃；GAPDH的上游引物序列為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，合成長度為500bp，退火溫度為60℃。

2.4.1.3 凝膠成像 制備1.5%瓊脂糖凝膠，放入電泳槽中。取5 μL樣本和1 μL上樣緩沖液，混合成6 μL上樣液。瓊脂糖凝膠上樣后接通電源，110 V，約1 h。放入凝膠成像系統拍照并分析條帶。

2.4.2 Western-blot法測定大鼠肝組織中GSK-3β、AKT的蛋白表達情況

2.4.2.1 蛋白樣品制備 取100 mg肝組織，于冰上在EP管內剪碎，加入裂解液，用超聲破碎儀充分勻漿裂解。將勻漿裂解液在離心機中4℃、14 000 rpm離心10 min；將上清液轉移至新的冰上預冷的1.5 mL EP管中，得到全蛋白提取物，可以進行蛋白定量。

2.4.2.2 BCA法測定蛋白含量 按說明書將蛋白樣本稀釋。試劑A：試劑B(50∶1)配制，計算樣本濃度。使每孔上樣蛋白量達40 μg，混勻后置沸水浴5 min。10 000 rpm轉1 min后直接取上清液上蛋白樣本。

2.4.2.3 電泳 配10%分離膠。配5%濃縮膠，膠液加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，然后將梳子水平插入，4℃靜置2h。將其放入電泳槽中，分別加入樣本和ladder。電泳時樣本在濃縮膠時恒壓80V，在分離膠時恒壓120V。取膠，將膠放置在含有轉膜液的托盤內。

2.4.2.4 轉膜 在冰盆中濕轉，1L濕轉液。將夾子放入轉膜槽中。恒壓100V，78 min定時。

2.4.2.5 封閉 根據目的蛋白分子量將膜剪成細條放入封閉盒內，加5%的封閉液，放入水浴箱內，37℃，緩慢振蕩1.5h。倒掉封閉液，TBST于搖床上洗3次，每次3 min。

2.4.2.6 抗體孵育與免疫反應 一抗滴加于膜上，室溫下輕搖孵育1h后4℃靜置過夜；膜用TBST洗3次，每次10 min于搖床上；加入稀釋二抗后放于37℃水浴中1 h；TBST洗3次，每次10 min。

2.4.2.7 化學發光 將發光液試劑盒按比例于EP管中混勻，滴加于膜上，放入發光儀進行曝光并拍照。

3 結果

3.1 飼養8周后各組大鼠體重的變化 各高脂飼料組與對照組相比較，大鼠體重明顯增加(P<0.05)，成功篩選出食源性肥胖大鼠。見表1。

組別體重/g對照組795.143±17.430 高脂飼料組1號籠960.000±36.240?高脂飼料組2號籠969.000±38.314?高脂飼料組3號籠949.571±44.806?高脂飼料組4號籠957.286±35.288?高脂飼料組5號籠966.000±38.803?高脂飼料組6號籠974.857±45.378?高脂飼料組7號籠957.143±36.821?高脂飼料組8號籠962.571±35.298?高脂飼料組9號籠954.286±36.931?高脂飼料組10號籠944.586±61.424?

注：與對照組比較，*P<0.05。

3.2 飼養12周后各組大鼠胰島素敏感指數的變化 各高脂飼料組與對照組相比較，大鼠胰島素敏感指數明顯下降(P<0.05)。見表2。

3.3 飼養12周后各組大鼠血液中胰島素水平的變化 各組間經兩兩比較，血液中胰島素水平差異無統計學意義(P<0.05)。見表3。

組別胰島素敏感指數對照組0.0185±0.00614 高脂飼料組1號籠0.0101±0.00412?高脂飼料組2號籠0.0097±0.00407?高脂飼料組3號籠0.0125±0.00557?高脂飼料組4號籠0.0121±0.00498?高脂飼料組5號籠0.0117±0.00450?高脂飼料組6號籠0.0112±0.00369?高脂飼料組7號籠0.0109±0.00352?高脂飼料組8號籠0.0105±0.00380?高脂飼料組9號籠0.0103±0.00403?高脂飼料組10號籠0.0101±0.00407?

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別胰島素水平/mIU/L對照組11.1024±2.39031 高脂飼料組1號籠12.1161±3.61210?高脂飼料組2號籠11.5857±2.84413?高脂飼料組3號籠11.3721±2.73974?高脂飼料組4號籠11.3277±2.72098?高脂飼料組5號籠11.0949±2.52838?高脂飼料組6號籠11.0109±2.50263?高脂飼料組7號籠10.7271±2.48023?高脂飼料組8號籠10.5540±2.30558?高脂飼料組9號籠10.5281±2.61187?高脂飼料組10號籠10.1854±2.61922?

注：與對照組比較，*P<0.05。

3.4 給予藥物干預后各組大鼠血糖水平的變化 模型組與對照組相比較，大鼠血糖水平明顯提高(P<0.05)；苦蕎麥總黃酮低、中、高劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠血糖水平明顯下降(P<0.05)，其中苦蕎麥中劑量組與西藥組降血糖效果較好。見表4。

組別血糖水平/mmol/L對照組4.286±0.302模型組28.957±0.439?苦蕎麥總黃酮低劑量組19.343±0.458#苦蕎麥總黃酮中劑量組5.929±0.431#苦蕎麥總黃酮高劑量組8.857±0.355#西藥組4.871±0.263#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3.5 給予藥物干預后各組大鼠血液中胰島素水平的變化 模型組與對照組相比較，大鼠胰島素水平明顯下降(P<0.05)；苦蕎麥總黃酮低、中劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠胰島素水平明顯提高(P<0.05)，其中苦蕎麥中劑量組、西藥組與對照組胰島素水平相近。見表5。

組別胰島素水平/mIU/L對照組11.809±1.300模型組9.108±0.775?苦蕎麥總黃酮低劑量組12.555±1.051#苦蕎麥總黃酮中劑量組11.117±1.360#苦蕎麥總黃酮高劑量組10.117±0.856西藥組11.071±0.6712#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3.6 給予藥物干預后各組大鼠胰島素敏感指數的變化 模型組與對照組相比較，大鼠胰島素敏感指數明顯下降(P<0.05)；苦蕎麥總黃酮中、高劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠胰島素敏感指數明顯提高(P<0.05)，其中苦蕎麥中劑量組與西藥組大鼠胰島素敏感指數與對照組相近。見表6。

組別胰島素敏感指數對照組0.0200±0.00196模型組0.0038±0.00035?苦蕎麥總黃酮低劑量組0.0041±0.0004#苦蕎麥總黃酮中劑量組0.0154±0.00133#苦蕎麥總黃酮高劑量組0.0112±0.00074#西藥組0.0186±0.00059#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3.7 各組大鼠肝組織中GSK-3β mRNA的相對表達情況 與對照組相比較，模型組組織中GSK-3β mRNA的表達明顯提高(P<0.05)；苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組和模型組相比較，GSK-3βmRNA的表達明顯下降(P<0.05)。如圖1所示，見表7。

3.8 各組大鼠肝組織中Akt mRNA的相對表達情況 與對照組相比較，模型組組織中Akt mRNA 的表達明顯減少(P<0.05)；苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組和模型組相比較，Akt mRNA 的表達明顯增加(P<0.05)。如圖2所示，見表8。

組別GSK-3β與GAPDH mRNA表達光密度比值對照組0.1727±0.01469模型組0.9228±0.05824?苦蕎麥總黃酮中劑量組0.8230±0.05311#西藥組0.5227±0.04111#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別Akt與GAPDH mRNA表達光密度比值對照組0.1567±0.01250模型組0.0631±0.00783?苦蕎麥總黃酮中劑量組0.1426±0.00948#西藥組0.0858±0.00781#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05。

3.9 各組大鼠肝組織中GSK-3β蛋白的相對表達情況 模型組與對照組相比較，組織中GSK-3β蛋白的表達明顯增加(P<0.05)；苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組與模型組相比較，GSK-3β蛋白的表達明顯減少(P<0.05)。如圖3所示，見表9。

組別GSK-3β與GAPDH 蛋白表達光密度比值對照組0.8125±0.03744模型組1.6740±0.09700?苦蕎麥總黃酮中劑量組1.2623±0.44680#西藥組1.0719±0.45873#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05。

3.10 各組大鼠肝組織中AKT蛋白的相對表達情況 模型組與對照組相比較，組織中AKT蛋白的表達減少有統計學差異(P<0.05)；苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組與模型組相比較，AKT蛋白的表達增加有統計學差異(P<0.05)。如圖4所示，見表10。

組別AKT與GAPDH 蛋白表達光密度比值對照組0.8982±0.02700模型組0.1420±0.00350?苦蕎麥總黃酮中劑量組0.7582±0.02462#西藥組0.4475±0.01009#

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

本實驗結果表明，苦蕎麥總黃酮低、中、高3個劑量組中，中劑量組效果最好。和模型組相比較，苦蕎麥總黃酮中劑量組與西藥組在控制T2DM大鼠血糖方面效果顯著，可明顯提高T2DM大鼠胰島素水平，提高其胰島素敏感指數。證明苦蕎麥總黃酮對T2DM大鼠的病情有積極影響，其機制與苦蕎麥總黃酮能使胰島素轉導通路中GSK-3βmRNA和蛋白表達減少、Akt mRNA和蛋白表達增加有關。

研究表明，多數T2DM患者存在IR[15]，降低IR是治療T2DM的關鍵[16]，IR與胰島素作用調節通路有關[17]。胰島素信號轉導通路中激活的Akt使 GSK-3β磷酸化而失活[18]，阻止GSK-3β對其底物糖原合成酶的磷酸化作用，糖原合成酶去磷酸化后恢復活性，發揮糖原合成作用，減少細胞中葡萄糖濃度。并且GSK-3β影響糖原合成酶活性不受胰島素濃度影響[19]。同時有實驗表明使用高選擇性抑制劑抑制GSK-3β 活性可增加葡萄糖的轉運從而提高胰島素的活性[20]，減少IR，進而達到降血糖作用。

因此，可以肯定激活Akt基因與蛋白表達、抑制GSK-3β基因與蛋白表達對降低T2DM大鼠血糖水平，升高胰島素敏感指數及改善胰島素抵抗有一定效果。苦蕎麥總黃酮通過影響胰島素信號轉導通路中GSK-3β與Akt兩個基因與蛋白的表達影響T2DM大鼠。

本實驗通過選擇使用鏈脲佐菌素(STZ)選擇性破壞動物胰島β細胞從而導致糖尿病[21-22]，目前國內廣泛采用高脂高糖飲食聯合注射小劑量STZ建立T2DM模型，該模型具有高血糖、胰島素抵抗等特點，與人類糖尿病發病過程和發病機理相似[23]。苦蕎麥作為一種藥食同源的植物，在改善T2DM的血糖水平，胰島素抵抗方面，有一定的開發潛力。