HPLC法測定大花胡麻草不同部位中2種環烯醚萜苷成分含量

張傳利 趙 秀 朱春梅 李維峰 馬 曉 杜華波 何素明

云南農業大學熱帶作物學院，云南 普洱 665099

大花胡麻草(CentrantheragrandifloraBenth.)又稱紅根野蠶豆、野蠶豆根[1]，是胡麻草屬草本植物，與地黃、玄參等中藥材同屬于玄參科(Scrophulariaceae)[2-3]，始載于《中華本草》，在云南、廣西、貴州等民間常將其根用于治療閉經，痛經、崩漏、小兒高熱、尿血、不孕癥、跌打損傷、外傷出血及風濕骨痛[4]，在開發治療心血管疾病、白血病、利尿、降壓、降糖、保肝等方面新型藥物及保健食品有很好的前景[5]。大花胡麻草根中含有杜鵑紅素、甘露醇以及多種環烯醚萜苷類物質[6-7]，環烯醚萜苷類物質藥用價值很高，是一類在自然界廣泛分布的天然產物，具有消炎、抗癌、防衰老、抗氧化、降血糖、強心、免疫調節活性等多種藥理活性[8]。大花胡麻草作為玄參科家族的一員，國內外對其研究較少，主要是集中在對大花胡麻草根的化學成分鑒定及部分成分的活性研究方面[1-3,7,9],而對根部以外的其他部位研究及各部位中的有效成分的含量研究還未見報道。基于此，本試驗運用HPLC測定栽培大花胡麻草中2種環烯醚萜苷的含量，以期探討梓醇和桃葉珊瑚苷在栽培大花胡麻草中的含量分布，為其藥用部位選擇、不同藥物和保健食品開發提供參考。

1 試劑與儀器

1.1 試劑 大花胡麻草新鮮樣品：采自于云南省紅河州屏邊縣，經普洱市民族醫藥研究所張紹云主任藥師鑒定為玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草(CentrantheragrandifloraBenth.)的根、莖、葉、花；桃葉珊瑚苷(純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為A117980-25 mg)與梓醇(純度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為 C110216-100 mg)對照品；乙腈(色譜純，德國 MERCK)、甲醇(色譜純，德國MERCK)、磷酸(分析純)，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器 安捷倫1200高效液相儀(安捷倫科技有限公司)；SK5200H型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；CN61M/DZF真空干燥箱(上海奧豪斯貿易有限公司)、ME204E電子分析天平(上海奧豪斯貿易有限公司)；純水/超純水系統(韓國HUMAN PowerI)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱定桃葉珊瑚苷、梓醇對照品1.08 mg、1.23 mg，至10 mL棕色容量瓶中，加各自流動相定容，搖勻，制成0.108 mg/mL的桃葉珊瑚苷溶液和0.123 mg/mL的梓醇溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱量根、莖、葉、花等部位樣品和混合樣(根莖葉質量比1∶1∶1)粉末0.5 g置于具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇5 mL，搖勻并稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHZ)30min，靜置5 min，用40%甲醇補足減失的質量，吸取溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過[10]，即得。

2.3 HPLC測定桃葉珊瑚苷和梓醇分析條件 桃葉珊瑚苷、梓醇測定色譜柱分別為Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、SPHERI-5RP-18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相分別為乙晴-水(3∶97)、甲醇-0.1%磷酸水(1∶99)；檢測波長分別為205 nm、210 nm；流速均為1 mL/min；進樣量均為20 uL；柱溫分別為25℃、35℃。桃葉珊瑚苷、梓醇HPLC色譜圖見圖1、2。結果表明，在此條件下，桃葉珊瑚苷保留時間約為 12.5 min，供試品溶液色譜圖在對照品溶液保留時間處有相同色譜峰，且與相鄰峰分離度符合要求。

2.4 線性關系考察 配制梓醇對照品溶液：0.0615、0.09225、0.123、0.15375、0.1845、0.5535、1.107 mg/mL；桃葉珊瑚苷對照品溶液：0.0036、0.036、0.072、0.108、0.144、0.180、0.216 mg/mL。在“2.3”項色譜條件下進樣，以對照品濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線[11]，得桃葉珊瑚苷、梓醇回歸方程分別為Y=16899435.76X+1357.21(r=0.9999)、Y=7097432.22X+3001.34(r=0.9999)。結果表明，分別在3.6～216.0 μg/mL、61.5～1107.0 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.1”對照品溶液20 μL，分別在“2.3”項色譜條件下，連續進樣6次，測峰面積，計算各峰面積RSD。得梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.67%、0.64%，表明儀器具有良好精密度。

2.6 重復性試驗 取栽培大花胡麻草各部位和混合樣粉末各6份，每份約0.5 g，精密稱定，在“2.2”項下配制后依次進樣，在“2.3”項下測定。得根、葉、花、混合樣梓醇平均含量分別為0.1557、10.8382、1.851、0.7256 mg/g，梓醇含量的RSD分別為1.85、0.14、0.66、0.85%；得根、莖、葉、花、混合樣桃葉珊瑚苷平均含量分別為0.9297、0.0398、0.3903、0.00382、0.3195 mg/g，葉珊瑚苷含量的RSD分別為0.73、1.02、0.66、1.97、0.94%。表明所建立方法具有良好的重復性。

2.7 穩定性試驗 取栽培大花胡麻草根供試品，在“2.2”項下配置0、2、4、8、12、24 h后依次進樣，分別考察梓醇和桃葉珊瑚苷的穩定性。得梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.48%、0.74%，表明在24 h內供試品溶液穩定

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取6份同批樣品粉末約0.25 g，同時精密加入梓醇對照品0.3 mL(0.123 mg/mL)、桃葉珊瑚苷對照品2.2 mL(0.108 mg/mL)，分別按“2.3”項色譜條件下測定。得梓醇、桃葉珊瑚苷平均回收率分別為99.87%、99.88%；RSD分別為0.61%、0.42%，具體結果見表1。

表1 梓醇和桃葉珊瑚苷加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.9 樣品含量測定 取大花胡麻草各部位和混合樣樣品各約0.5 g，平行6份，按“2.2”項方法制備供試品溶液，在“2.3”項下測定，分別吸取各樣品20 μL，計算各部位樣品含量。具體結果和含量比較見表2、圖3。

由表2和圖3可知，在栽培大花胡麻草植株中，桃葉珊瑚苷在各部位均有分布，以根中最高，且與其他部位間存在顯著差異；梓醇在根、葉、花等部位中有分布，在莖中未檢出，以葉中最高，檢出各部位間均存在顯著差異。

表2 栽培大花胡麻草根、莖、葉、花中梓醇和桃葉珊瑚苷含量測定結果

注:數據后字母表示P<0.05水平的差異顯著性;“-”表示未檢測到該部位含量。

3 結論與討論

大花胡麻草為環烯醚萜苷類化合物來源的一類天然產物資源，從表2和圖3可知，梓醇和桃葉珊瑚苷在栽培大花胡麻草各部位中幾乎均有分布，但不同部位間的含量卻存在顯著差異，2種環烯醚萜苷活性成分在植株內分布規律也不一致，梓醇在植物內的含量表現為：葉>花>混合樣>根，栽培葉中含量高達10.838 mg/g，是其它部位的5.9～69.5倍，且葉中梓醇含量是藥典規定最低含量的5.4倍以上；桃葉珊瑚苷在植物體內的含量表現為：根>葉>混合樣>莖>花，栽培根中含量最高為0.930 mg/g，是其它部位的2.4～232.5倍。近從梓醇和桃葉珊瑚苷兩種活性成分在栽培大花胡麻草植株內分布和含量分析結果可初步得出云南民間習慣以根入藥和作為產品開發的部位從不同物質功效和治療效果上在一定程度上是不合理的，且除根以外的其他部位可根據不同功效需求來開發不同的產品，是可以合理利用，如花中含量微量的桃葉珊瑚苷可以作為開發花茶的原料；另外，根、莖、葉按質量1∶1∶1的比例混合樣中桃葉珊瑚苷和梓醇含量均適宜，適合用于開發復合功效產品的原料。

本實驗只分析比較了來源同一產地的栽培大花胡麻草不同部位中梓醇和桃葉珊瑚苷的含量差異，但不同生態環境對生物活性成分的有效積累影響較大，其他產地和不同栽培條件下栽培大花胡麻草中梓醇和桃葉珊瑚苷的含量是否在植株內符合本實驗的研究結果，需要進一步研究。

本研究測定并分析比較了栽培大花胡麻草中2種環烯醚萜苷的含量，得到了梓醇和桃葉珊瑚苷在栽培大花胡麻草植株內的含量和分布規律，并在參照《中國藥典》(2015年版，一部)[12]中高效液相色譜法的基礎上對提取溶劑、溶劑濃度和流動相分離比例進行篩選和優化，建立了分離效果較好的色譜條件，為今后有效測定栽培大花胡麻草中環烯醚萜苷類活性成分提高一定的科學依據，且在精密度、穩定性、重復性和回收率等指標方面均表現良好，也為今后該天然產物資源質量控制提供一定參考。