藏藥三味寬筋藤湯散質量標準研究

1.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000；2.阿壩州藏醫醫院，四川 馬爾康 513229

三味寬筋藤湯散，藏文音譯是“勒哲松湯”，原方載于《四部醫典》，由寬筋藤、渣馴膏、訶子肉三味藏藥組成[1]，劑型為湯散劑，具有祛風除痹、消腫止痛、干黃水的作用。用于關節急慢性紅腫、脹痛、伸屈不利、四肢僵硬，痛風、痹證。作為經典藏藥處方，在阿壩州藏醫醫院臨床上主要應用于類風濕性關節炎、痛風等，效果佳，但通過查詢尚無其質量控制的相關文獻報道。訶子為 《中國藥典》收載的傳統藥物品種，尤其在民族醫學藏藥和蒙藥中最為常用[2]，為本處方的主要藥味之一，其有效成分沒食子酸的含量較高。沒食子酸具有解痙、抗氧化、抗菌及強心等藥理作用[3]，與三味寬筋藤湯散的臨床藥效密切相關。本文初步建立藏藥三味寬筋藤湯散的質控項目，采用顯微鑒別法、薄層色譜法、理化鑒別法定性鑒別藏藥三味寬筋藤湯散中的寬筋藤、訶子2味藥材，高效液相色譜法測定沒食子酸相對含量，這對建立藏藥的質量標準有著重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；BX35生物顯微鏡II (奧林巴斯醫療株式會社)；JPCT0328全數字超聲波發生器(武漢嘉鵬電子有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；AUW120D電子天平(SHIMADZU)；JA203H型電子天平(常州市幸運電子設備有限公司)；HH-S8數顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)。

1.2 材料 沒食子酸對照品(批號：110831-201605，中國食品藥品檢定研究院)；訶子對照藥材(批號：121015-201605，中國食品藥品檢定研究院)；寬筋藤、訶子肉、渣馴藥材，經阿壩州藏醫醫院澤戈主任藏醫藥師鑒定為正品，均由阿壩州藏醫醫院制劑中心提供；三味寬筋藤湯散(批號：20190211，阿壩州藏醫醫院配制)；甲醇為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 寬筋藤為莖類藥材，渣馴膏為巖石中富含腐殖質的古生物化石在地質作用下滲出后，與復齒鼯鼠或紅耳鼠兔糞粒的混合物[4]，訶子肉為果實類藥材，三者顯微特征差別較大，具有互不干擾的專屬性特征，并易于觀察。將三味寬筋藤湯散制片后(染色片、水合氯醛透化片、水裝片等)，置于顯微鏡下觀察。

2.1.1 寬筋藤 將三味寬筋藤湯散制片后在顯微鏡下觀察，可見韌皮纖維成束，周圍薄壁細胞含方晶成晶鞘纖維，為寬筋藤的顯微特征[5]。

2.1.2 訶子肉 將三味寬筋藤湯散制片后在顯微鏡下觀察，可見多數石細胞，呈類方形、類多角型或不規則形，有的一端稍膨大，細胞壁上紋孔密集，為訶子的顯微特征[6]。

2.2 理化鑒別[7]寬筋藤中主要成分為生物堿[8]，參考藥品標準，對其生物堿進行理化鑒別。取寬筋藤藥材、三味寬筋藤湯散、三味寬筋藤湯散(缺寬筋藤)三種粉末各5 g，分別加入酸性乙醇30 mL，回流30 min，濾過，取濾液15 mL，用5%氫氧化鈉溶液調至中性，水浴上蒸干，加入6 mL5%硫酸溶液溶解，濾過，取濾液3 mL分置A、B、C三支小試管中，每支試管1 mL，依次加入碘化鉍鉀試液、碘化汞鉀試液、硅鎢酸試液1～2滴，結果見表1。

表1 理化鑒別結果

2.3 薄層鑒別 參考文獻[9]和2015 年版《中國藥典》四部通則0502 薄層色譜法[10]，精密稱取三味寬筋藤湯散2 g，訶子對照藥材0.5 g，三味寬筋藤湯散(缺訶子肉)2 g，分別加入5 mL乙醇溶液，超聲處理(功率250W，頻率40kHZ)0.5 h，放冷，取上清液濾過，取續濾液，待用。吸取上述三種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。三味寬筋藤湯散與訶子對照藥材在色譜相應的位置，顯相同顏色的斑點，三味寬筋藤湯散(缺訶子肉)無干擾。如圖1所示。

2.4 HPLC法測定沒食子酸的含量

2.4.1 色譜條件[11-12]色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40℃；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液(2∶98)；流速1.0 mL/min；檢測波長273 nm；進樣量10 μL，理論塔板數按沒食子酸計算應不低于2000。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品10.65 mg，置25 mL棕色量瓶中，加入50 %甲醇溶解并定容，即得0.426 mg/mL溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取三味寬筋藤湯散(20190211)0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減少的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液 按處方(除訶子肉藥材外)與制法，制成陰性樣品溶液。其余處理同供試品溶液。

2.4.5 測定法 分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。如圖2所示。

2.4.6 線性關系考察 精密吸取“2.4.2”項下沒食子酸對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，得到對照品溶液濃度分別為：0.004 26、0.021 3、0.042 6、0.106 5、0.213、0.426 mg/mL溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣10 μL測定峰面積，以色譜峰面積為縱坐標(y)，對照品溶液濃度為橫坐標(x)進行回歸，得回歸方程為y=29193x+ 141618(R2=0.9993)，在0.004 26～0.426 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.4.7 精密度試驗 精密吸取“2.4.2”項下沒食子酸對照品溶液0.5 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，精密吸取10 μL，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6次，測得其平均峰面積值為717643，RSD為1.88%。表明儀器精密度良好。

2.4.8 穩定性試驗 取“2.4.3”項下供試品溶液10 μL，按“2.4.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測得峰面積RSD為1.42%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.9 重復性試驗 取同一批號(20190211)樣品6份，按2.4.3方法制備，按“2.4.1”項下色譜條件測定，結果沒食子酸平均相對含量為5.37 mg/g，RSD為0.88%，表明此方法重復性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗 取三味寬筋藤湯散(20190211)6份，每份約0.2 g，精密稱定，1、2號樣品加入含有量50%沒食子酸對照品，3、4 號樣品加入含有量 100%沒食子酸對照品，5、6 號樣品加入含有量 150%沒食子酸對照品，按“2.4.3”項下方法制備，按“2.4.1”項下色譜條件，各取10 μL進樣檢測，結果見表2。

表2 沒食子酸加樣回收率結果 (n=6)

2.4.11 耐用性 取三味寬筋藤湯散(20190211)，按“2.4.3”項下方法制備，分別在色譜條件小的變動條件下：柱溫(40.0±5)℃，流速(1.0±0.2)mL/min，波長(273±2)nm，測定沒食子酸相對含量的RSD為1.62%，結果表明，此高效液相色譜條件測定沒食子酸對照品時，柱溫、流速、波長的變動小時耐用性強，滿足系統適應性要求，本方法準確可靠。

3 討論

3.1 理化鑒別 寬筋藤藥材標準鑒別項下中有加新配重氮化試劑，顯紅色，由于三味寬筋藤湯散含渣馴膏，其在提取過程中溶液顯酒紅色，這個顏色反應不明顯，故選擇碘化鉍鉀試液、碘化汞鉀試液、硅鎢酸試液作為三味寬筋藤湯散的理化鑒別的顯色試劑，沉淀明顯。

3.2 薄層鑒別 預實驗按照《中國藥典》2015年版訶子項下對訶子藥材進行定性分析，樣品處理方法過于復雜，且重復性較差；樣品處理方法直接選擇超聲處理(功率250W，頻率40kHZ)0.5 h，放冷，取上清液濾過，取續濾液，待用；展開劑調整為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶10∶1)，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱顯色，日光下檢視，對照藥材主斑點顯色明顯，供試樣品相應位置斑點分離較好且陰性供試品無干擾。

3.3 色譜條件的選擇 根據參考文獻[11-12]，選擇流動相：乙腈-0.05%甲酸水溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液，結果表明甲醇-0.2%磷酸對三味寬筋藤中沒食子酸的分離效果較好。經反復實驗，最終確定流動相為甲醇-0.2%磷酸(2∶98)，既能確保柱效的穩定性，又可達到較好的分離效果。