蛋白激酶D1調控膠原表達逆轉心肌梗死后心室重構的作用

楊 雷，劉 暖，毛秉豫

心肌梗死(myocardial infarction, MI)后心肌組織的缺血受損可導致心室重構(ventricular remodeling, VR)；心肌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在VR的進程中發揮著重要的作用，特別是和ECM的主要組成成分Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ， ColⅠ)和Col Ⅲ的大量積聚密切相關[1]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的主要功能之一是降解ECM，而ECM的過度降解也是引發VR的重要原因之一[2]。在組織重塑過程中，基質金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinase inhibitors， TIMPs)被分泌并抑制MMPs的活性水平。因此MMPs和TIMPs的動態平衡調節也是影響VR的關鍵因素之一[2]。前膠原C端蛋白酶增強子(procollagen C-terminal protease enhancer， PCPE)、富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine， SPARC)、粘膠蛋白/肌腱蛋白C(tenascin C， TN-C)和核轉錄因子(nuclear transcription factor， NF-κB) p50也是參與膠原代謝的代表性調控蛋白[2-3]。

研究[4-6]表明，蛋白激酶D1(protein kinase D1, PKD1)具有促缺血受損心肌組織血管新生的作用，但其對MI后心肌膠原蛋白表達的調控作用尚不清楚。該研究旨在探討PKD1給藥4周是否會影響大鼠MI后的VR，并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物45只SPF級雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，8周齡，體質量200～220 g，所有動物在標準飼養的環境下(溫度和濕度范圍分別為22～26 ℃和53%～60%飼喂食物和飲水，并在南陽理工實驗動物倫理委員會(實驗批準號：NYIST-20180126)監控下進行。

1.2 藥物與試劑PKD1購自美國Pierce公司；MMP-1、MMP-8、TIMP1、ColⅠ、Col Ⅲ、PCPE、SPARC、TN-C、NF-κB p50的一抗抗體均購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司；羊抗兔IgG二抗、DAB顯色液、BCA蛋白測定試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.3 主要儀器164-5052型PowerPac HC電泳儀(美國BIO-RAD公司)；T25組織勻漿機(德國IKA公司)；HX-100E型小動物呼吸機、BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)；ERM-3100型半自動病理切片機(蘇州郝思琳科技有限公司)；TKY-BMB型石蠟包埋機(深圳博大精科技實業有限公司)；Nikon Tis型熒光顯微鏡及Nikon NIS-Elements Software BR分析系統(日本尼康公司)。

1.4 動物造模雄性Wistar大鼠45只，按照數字隨機法分為3組，假手術組(Sham組)、模型組(Model組)和PKD1給藥組(PKD1組)，每組大鼠均15只。參照之前的方法[6]，Model組和PKD1給藥組結扎大鼠左冠狀動脈前降支造成MI，Sham組僅履行手術程序但不結扎冠狀動脈。術后3 d，PKD1組開始給予PKD1灌胃給藥，即按照每日1 mg/(kg·d)的劑量稀釋至2 ml生理鹽水中，連續灌胃4周。Sham組和Model組每日生理鹽水灌胃2 ml，連續4周。在4周結束時，應用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠，進行血流動力學評估。評估結束，75 mg/kg戊巴比妥鈉深麻醉下頸總動脈放血法處死動物，進行后續分析。

1.5 血流動力學評估通過侵襲性手術評估動物的血流動力學數據。動物腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，將SPR-838壓力容積導管經左頸動脈插入左心室(left ventricle, LV)腔內。連續監測LV的壓力和容積，以便正確定位導管，定位后的導管被連接到壓力換能器上。通過BL-420F生物機能實驗系統記錄左室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左室壓最大上升和下降速率等數據。

1.6 HE染色及心肌細胞橫截面面積測定取處死后大鼠的心臟，將左心室與其他心臟結構分離，用10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作組織學4 μm厚切片，參照之前的方法[4]，制作HE染色切片，根據Stefanon et al[7]所描述的方法，光學顯微鏡400×放大視野下對左心室未梗死區域心肌組織進行分析，每只大鼠觀察5個視野，手動計數50個細胞(10個細胞/視野)，采用Nikon NIS-Elements Software BR分析軟件測量心肌細胞橫截面積，作為評估MI后心室肥厚程度的指標之一。

1.7 Masson染色心肌組織取材同HE染色部分。參照之前的方法[6]，制作Masson染色病理切片。染色后，心肌膠原纖維在光鏡下呈藍綠色，心肌組織呈現紅色，膠原容積分數(collagen volume fraction, CVF)采用日本尼康公司的軟件分析系統Nikon NIS-Elements Software BR進行分析。

1.8 Western blot檢測取心尖部心肌組織，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液浸泡后，IKA-T25組織勻漿機將樣品進行均勻化和離心分離，提取總蛋白。用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白量。取40 μg的蛋白質應用于SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白條帶轉移到0.2 μm硝酸纖維素膜上。用蛋白封閉液封閉2 h后與MMP-1、MMP-8、TIMP1、ColⅠ、Col Ⅲ、PCPE、SPARC、TN-C和NF-κB p50的一抗抗體孵育。加入辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔二抗，孵育2 h，置入DAB顯色溶液中顯色，以β-actin蛋白表達水平作為內參對照，AlphaView SA軟件分析各樣本與β-actin蛋白灰度的比值，記錄蛋白相對含量。

2 結果

2.1 PKD1對MI大鼠血流動力學的影響與Sham組比較，Model組大鼠LVSP、左室壓最大上升和下降速率值均減小(P<0.01)，而LVEDP增大(P<0.01)；與Model組比較，PKD1組大鼠LVSP、左室壓最大上升和下降速率值均增大(P<0.01)，而LVEDP減小(P<0.01)，且所有值接近于Sham組大鼠。見表1。

2.2 PKD1對MI大鼠組織形態學的影響3組大鼠HE染色組織形態學結果表明，Sham組大鼠呈現清晰規整的紅色心肌，細胞輪廓清晰；Model組大鼠心肌組織壞死嚴重，壞死的心肌被瘢痕組織取代，殘存的心肌細胞明顯肥大(綠色箭頭)，成纖維細胞(黃色箭頭)增生明顯，伴炎癥細胞(紅色箭頭)浸潤；PKD1治療組大鼠心肌細胞較Sham組仍顯肥大，紅色心肌組織結構清晰，少見壞死心肌和炎癥細胞浸潤，伴隨明顯的毛細血管和散在分布的紅細胞。

表1 PKD1對MI大鼠血流動力學的影響

與Sham組比較：**P<0.01；與Model組比較：##P<0.01

圖1 PKD1對MI大鼠組織形態學的影響 HE×400

A： Sham組；B： Model組；C： PKD1組；綠色箭頭示心肌細胞，黃色箭頭示成纖維細胞，紅色箭頭示炎癥細胞

表2 PKD1對MI大鼠心肌組織的膠原占比和心肌細胞截面積的影響

與Sham組比較:**P<0.01；與Model組比較:##P< 0.01

圖2 PKD1對MI大鼠心肌纖維化的影響 Masson×400A： Sham組；B： Model組；C： PKD1組

見圖1。

2.3 PKD1對MI大鼠心肌細胞截面積的影響3組大鼠非梗死區心肌細胞的截面積分析結果表明，Sham組大鼠心肌細胞的截面積正常；與Sham組比較，MI大鼠殘存非梗死區域心肌組織中心肌細胞的截面積增大(P<0.01)；與Model組比較，PKD1組大鼠心肌組織中心肌細胞的截面積減小(P<0.01)，但較Sham組增大(P<0.01)。見表2、圖1。這表明PKD1給藥后可改善MI大鼠心肌細胞的肥大程度。

2.4 PKD1對MI大鼠心肌纖維化的影響3組大鼠心肌組織的纖維化程度和膠原占比分析結果表明，Sham組大鼠心肌組織中紅色的心肌組織中間雜有藍色的膠原纖維，但膠原占比較少；與Sham組比較，Model組大鼠殘存的紅色心肌組織較少，心肌組織壞死嚴重，壞死的心肌組織由大片藍色的膠原纖維取代，膠原占比升高(P<0.01)；與Model組比較，應用PKD1后，心肌組織壞死的程度明顯減輕，膠原纖維占比下降(P<0.01)。見表2、圖2。這表明，PKD1給藥后可改善MI大鼠心肌組織的壞死程度，降低心肌組織的膠原占比。

2.5 PKD1對MI大鼠心肌組織中膠原相關蛋白表達的影響Western blot結果表明，與Sham組比較，MI大鼠殘存心肌組織中MMP-1、MMP-8、ColⅠ、Col Ⅲ、PCPE、SPARC、TN-C和NF-κB p50的表達均升高(P<0.01)，TIMP1表達降低(P<0.01)；與Model組比較，PKD1組大鼠心肌組織中TIMP1的表達升高(P<0.01)，而MMP-1、MMP-8、ColⅠ、Col Ⅲ、PCPE、SPARC、TN-C和NF-κB p50的表達均降低(P<0.01)，但除了NF-κB p50的表達外，均仍高于Sham組(P<0.01)。這表明PKD1給藥可影響MI大鼠心肌組織中膠原相關蛋白的表達。見圖3。

3 討論

MI后受損心肌組織的ECM中膠原產生和沉積增多，導致心肌纖維化、心室壁僵硬以及心肌的收縮和舒張功能障礙[8]。本研究表明，PKD1在改善MI大鼠心肌組織的血流動力學方面作用顯著，這與之前的動物實驗研究[4]結果相一致，表明PKD1治療可減輕心臟的損傷程度，改善心臟的收縮和舒張功能障礙。

圖3 PKD1對MI大鼠心肌組織膠原相關蛋白表達的影響

1：MMP-1；2：MMP-8；3：TIMP-1； 4：Col Ⅰ;5:Col Ⅲ;6:PCPE;7:SPARC;8:TN-C;9:NF-κB p50；與Sham組比較：**P<0.01；與Model組比較：##P<0.01

本研究通過Masson染色分析評估了MI心肌組織的膠原占比，證實PKD1治療可有效減輕心肌組織的纖維化程度。并證實PKD1可下調心肌組織中ColⅠ、Col Ⅲ、MMP-1和MMP-8的表達。MMPs在心肌組織中被激活后可迅速降解ECM成分，導致心室壁變薄和擴張，心肌纖維化而引發VR，甚至可能導致心功能衰竭[9]。因此，MI后MMPs的分泌增多很可能是VR及心力衰竭發生的起始因素[9-11]。TIMPs是MMPs的特異性內源性調節因子，TIMPs參與調控心肌炎癥和心室腔擴張的進程[10]，是維持心室幾何結構的基礎[11]。本研究顯示PKD1可下調MMP-1和MMP-8的表達，并上調TIMP1的表達。這表明PKD1可能通過上調TIMPs和下調MMPs的表達而減少ECM的過度降解，抑制心肌纖維化的進展，減輕心肌組織的膠原沉積，并最終逆轉VR。

PKD1還通過調控兩種特異性蛋白PCPE和SPARC的表達而影響膠原的合成。PCPE具有增強前膠原C蛋白酶調控合成新膠原蛋白的作用[12]。SPARC通過與膠原蛋白前體的結合而調節新膠原纖維的形成[13]。本研究證實，PKD1可下調PCPE、SPARC、ColⅠ和Col Ⅲ的表達水平。這表明PKD1可有效減少組織膠原的合成并促進其降解，從而改善心肌組織的纖維化程度。

TN-C參與新膠原分子的形成并調節NF-κB活化[14]。TN-C的缺失可減少MI后心肌纖維化程度，并改善心臟的舒張功能而減輕MI后的心功能障礙[13]。本實驗表明PKD1治療可減少MI大鼠心肌組織中的TN-C及NF-κB p50的表達。這可能是由于PKD1治療抑制了TN-C和NF-κB p50激活的炎癥信號通路參與的VR。

本研究還顯示，PKD1用藥組大鼠心肌細胞橫截面積、心肌細胞的肥大程度及膠原相關蛋白的含量，盡管較Model組明顯改善，但較Sham組仍存在著差異。這表明PKD1用藥在抑制心肌肥厚方面的作用是有限的。然而，PKD1用藥組大鼠在改善MI大鼠的血流動力學方面卻十分顯著，幾乎接近于Sham組大鼠，而血流動力學指標又是評估心功能的重要指標之一。據此，課題組推測PKD1改善MI后的VR作用除了和一定程度上逆轉心肌肥厚有關，同時也可能與PKD1的促血管新生作用密切相關[4-6]。PKD1作用后誘導新的毛細血管生成，可以滿足肥厚心肌的血供，而這種肥厚的心肌在保證心肌強有力收縮的同時并不引發心肌缺血。因而，PKD1用藥后未完全被抑制的心肌肥厚未必是一種病理性心肌肥厚，有可能是一種生理性肥厚，這對于基于“PKD1”靶點的新藥開發提供了一種新的思路。