KLK7在肝細胞癌中的表達及其意義

陳 康，莢衛東，葛勇勝，陳 新

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟最常見的原發性惡性腫瘤，占全球肝癌總數的70%～85%，是世界范圍內第五大常見腫瘤之一，也是全球癌癥相關死亡的第二大原因。在過去的20年中，HCC的發病率增加了2倍，而5年生存率仍然低于12%[1]，每年大約發生782 500例新病例和745 500死亡病例，僅中國的新生病例和死亡占總數的一半左右[2]。鑒于肝細胞癌發生是通過遺傳、表觀遺傳和信號傳導程序的復雜變化而產生的，HCC表現出廣泛的異質分子特征[3]，正是存在這種多樣性，HCC細胞具有強大的細胞存活性和增殖表型。闡明HCC起始和進展的分子機制可以改善診斷和治療策略。因此，迫切需要在該領域進行旨在鑒定可靠的早期診斷生物標志物和有效治療選擇的研究。

人激肽釋放酶7(kallikrein related peptidase 7，KLK7)，也曾被稱為角質層胰凝乳蛋白酶(stratum corneur chymotryptic enzyme，SCCE)，屬于激肽釋放酶相關肽酶家族,作為皮膚中最突出的蛋白酶之一，這種酶通過降解幾種不同的底物而促進脫屑和皮膚免疫系統活化[4]，因此它作為治療皮膚病的潛在靶點而被廣泛研究。然而在最近的報道中，KLK7在其他多種惡性腫瘤中顯示出較高的研究價值，如研究人員發現KLK7在宮頸癌、結腸癌、胰腺癌等的腫瘤組織中表達上調，而在乳腺癌和腎癌中表達下調[5]。但在肝細胞癌研究中，尚未見國內外有相關文獻報道，該研究旨在探討KLK7在肝細胞癌中的臨床病理學意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2015年1月～2017年12月于安徽醫科大學附屬省立醫院肝臟外科行根治性肝細胞癌切除術，術后經病理確認且具備完整隨訪資料的88例石蠟切片，其中男68例，女20例；年齡20～73(52±12)歲；據Edmondson分級法標準行腫瘤分級，Ⅰ～Ⅱ級63例，Ⅲ～Ⅳ級25例；腫瘤TNM分期標準依據美國癌癥聯合會(AJCC)第八版標準，Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期36例。另外收集本院肝臟外科近期行根治性肝細胞癌切除術的新鮮冷凍HCC組織及其對應癌旁組織20對和TRIzol浸泡的HCC組織及其對應癌旁組織20對，行Western blot及qRT-PCR檢測。所選患者術前未行放療、化療、介入等抗腫瘤治療。

1.2 主要試劑KLK7 PAB910Hu01(武漢優爾生商貿有限公司)；通用型二抗試劑盒PV-6000、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RIPA細胞裂解液(上海碧云天生物技術研究所)；蘇木精BA-4041(珠海貝索生物技術有限公司)；TRIzol試劑(美國Life technogies公司)；qRT-PCR 引物合成(生工生物工程上海股份有限公司)；ECL超敏發光試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1Western blot 剪取肝癌及對應癌旁組織均約100 mg，加入RIPA細胞裂解液進行裂解后提取總蛋白，使用BCA法進行蛋白的定量測定，每對樣本等量蛋白上樣，電泳結束后，分離蛋白并將蛋白轉至PVDF膜上，轉膜完畢后，立即把PVDF膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗5 min，以洗去膜上的轉膜液。加入封閉液(5%脫脂奶粉)，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉2 h。KLK7-1抗體在4 ℃搖床中用兔抗1 ∶200稀釋液(10%分離凝膠)孵育過夜，之后用PBST溶液洗膜3次。二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，PBST液洗滌3次后使用ECL超敏發光試劑盒來檢測蛋白，采用北京科創銳新生物凝膠成像系統對掃描、保存后的圖像進行灰度值分析。同法用兔抗人β-actin 作內參對照；獲取KLK7條帶灰度值與β-actin 灰度值之比用于統計學分析。

1.3.2qRT-PCR 提取肝癌及癌旁組織總RNA，用于合成cDNA,隨后使用三步法進行qRT-PCR反應，設置擴增條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，共計40個循環，每基因樣本設置3次重復。KLK7引物正向序列：5′-CGAGCCCAGATGTGACCTTT-3′，反向序列：5′-GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′，擴增產物長度：155 bp；內參(β-actin)引物正向序列：5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，反向序列：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′，擴增產物長度為96 bp；KLK7 mRNA相對表達量用2-ΔΔCt進行計算。

1.3.3免疫組化 本實驗采用PicTureTM二步SP法對肝細胞癌及癌旁組織中KLK7的表達進行檢測。根據KLK7抗體的特殊要求,通過脫蠟和水合預處理組織切片。3% H2O2去離子水孵育5 min用以阻斷內源性過氧化物酶，PBS漂洗。用KLK7抗體滴注1 ∶200,在37 ℃下孵育90 min后用PBS沖洗3次,每次2 min。滴下通用IgG抗體(Fab段)-HRP聚合物,在37 ℃下孵育30 min后用PBS沖洗3次，每次2 min。蒸餾水沖洗、復染、脫水和密封。免疫組化實驗結果判定標準：首先根據切片著色細胞強度評分：顯色不清或不顯色者計為0分；淺黃色計為1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。另外對于每張組織切片都隨機選擇5個高倍視野(400倍)，根據著色細胞所占百分比評分：0～25%細胞著色為1分；26%～50%細胞著色為2分；51%～75% 細胞著色為3分；76%～100%細胞著色為4分。切片最終分數=著色細胞所占百分比分數×著色細胞強度評分，分數≥6分定為高表達，得分<6分定為低表達。

2 結果

2.1 Western blot與qRT-PCR實驗結果通過Western blot法檢測HCC中KLK7表達情況，定量結果顯示HCC組織中KLK7相對含量(1.45±0.24)高于癌旁組織(0.65±0.16)，差異具有統計學意義(t=28.03，P<0.001)，見圖1。qRT-PCR 檢測結果顯示，20對標本中KLK7在癌組織中的mRNA表達均高于對應癌旁組織，定量結果顯示KLK7在HCC組織及對應癌旁組織中的mRNA相對表達量分別為(18.39±18.18)和(9.11±13.73)，差異有統計學意義(t=5.804，P<0.001)，見圖2。

圖1 Western blot法檢測KLK7的表達

A：KLK7蛋白在4對代表性HCC及對應癌旁組織中的表達；B：KLK7蛋白在20對HCC及對應癌旁組織中的相對表達量;與癌旁組織比較：***P<0.001

圖2 qRT-PCR法檢測KLK7 mRNA在20對肝癌及癌旁組織中相對表達量與癌旁組織比較：***P<0.001

2.2 免疫組化結果本研究通過對88例組織切片觀察結果顯示，有58例顯示KLK7在HCC細胞質中呈高表達(65.9%)，低表達有30例(34.1%)。在對應癌旁組織中有26例呈高表達(29.5%)，低表達有62例(70.5%)，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3、4。

圖3 HCC組織與癌旁組織KLK7的表達 ×100

A、C：KLK7在HCC組織中的表達；B、D:KLK7在癌旁組織中的表達

2.3 KLK7在HCC組織中的表達與臨床病理因素的關系KLK7在HCC組織中的表達上調與腫瘤直徑、腫瘤Edmondson分級、腫瘤TNM分期有關(P=0.011、0.016、0.006)；與年齡、性別、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、腫瘤包膜、肝硬化等無關(均P>0.05)，見表1。

圖4 HCC組織與癌旁組織KLK7的表達 ×400

A、C：KLK7在HCC組織中的表達；B、D:KLK7在癌旁組織中的表達

表1 KLK7的表達與患者臨床病理特征之間的關系(n)

3 討論

人激肽釋放酶基因家族由15個同源分泌的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶組成，由染色體19q13.4區域中發現的緊密聚簇基因編碼,人激肽釋放酶的異常表達干擾惡性腫瘤生長的不同階段，特別是在腫瘤轉移和侵襲中，這可能是因為其在從胚胎發育到組織重塑的生理過程中都起到重要作用，并通過協助基底膜和結締組織細胞外基質的降解而在惡性腫瘤的擴散中發揮重要作用密切相關[6]。KLK7是一種類似胰凝乳蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，屬于激肽釋放酶家族，最初是從皮膚中提純得到的,如其他激肽酶家族成員一樣，KLK7同樣以組織特異性方式表達，并且分別受轉錄和轉錄后機制如類固醇激素(雄激素反應元件)和絲氨酸蛋白酶抑制劑的調節，因其在腫瘤的發生發展中可能發揮重要作用而作為癌癥生物標志物被廣泛研究。

Du et al[7]在胰腺癌研究中發現KLK7在胰腺癌中呈現高表達，進一步沉默KLK7基因后誘導獲得腫瘤的抗遷移和抗侵襲能力，將其相關的分子機制解釋為KLK7對細胞外基質蛋白和連接、黏附分子的切割導致的。蘇曉峰 等[8]也同樣證實了KLK7在胃癌中的高表達后篩選出沉默KLK7效率最高的KLK7-siRNA-416片段，瞬時轉染入胃低分化腺癌AGS細胞株，發現KLK7沉默后在mRNA水平及蛋白水平均勻下調。這一研究證明了胃癌細胞增殖變化的過程中有著KLK7的參與，KLK7基因的沉默影響了細胞周期的前DNA合成從而抑制細胞增殖。Xi et al[9]也通過鼠異種移植實驗檢查KLK7表達及在體內調節食管腺癌的生長情況，證實了KLK7在食管腺癌中起致癌基因的作用，其可能的機制也與KLK7切割細胞間連接分子相關。在另外一項關于黑色素瘤的研究中，Yu et al[10]發現高表達水平的KLK7表達與黑素瘤患者的良好預后相關，這是少數關于高表達KLK7在腫瘤中起保護作用的報道。上述研究中，包括以往的另外一些研究[11-12]，KLK7在腫瘤中的作用機制通常被描繪為直接降解細胞外基質的組成成分(例如纖連蛋白)促進腫瘤的轉移，同時還通過降解橋粒蛋白如橋粒蛋白1和橋粒芯糖蛋白2，導致細胞黏附減少并促進腫瘤細胞侵襲，在腫瘤發生發展中起重要作用。目前人們了解到細胞外蛋白水解通過主動降解和修飾細胞外基質而促進腫瘤進展，導致惡性腫瘤的侵襲和最終轉移。幾種蛋白酶系統在癌癥中持續失調，并且它們負責的信號傳導直接影響腫瘤微環境[13]。這些蛋白水解級聯中的非常重要的兩個蛋白酶是基質金屬蛋白酶和屬于絲氨酸蛋白酶的尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)及其受體(uPAR)，而這兩種蛋白酶又恰恰是被幾種激肽釋放酶激活的，這其中也包括KLK7。這種失調通常會改善癌癥進展的條件，例如通過增加細胞黏附受體來促進細胞黏附和細胞遷移，并在釋放細胞外生長因子后產生化學梯度。

KLK7在生理學和病理學作用已在各種組織中廣泛研究，特別是皮膚、胰腺這些廣泛受到激素調節的組織，然而其在肝臟中的生理和病理學作用仍然知之甚少，國內外尚未見對KLK7在HCC中表達情況及其與HCC患者臨床病例特征之間關系的探討，本研究旨在檢測KLK7在HCC中的表達情況，并分析KLK7的表達與HCC患者相關臨床病理特征之間的關系。一方面本研究進行免疫組織化學實驗、qRT-PCR、Western blot實驗顯示KLK7在HCC中呈現高表達，另一方面本研究通過對臨床資料的分析顯示，KLK7的表達上調與腫瘤直徑、腫瘤Edmondson分級、TNM分期有關(P=0.011、0.016、0.006)，而與年齡、性別、腫瘤包膜、AFP、肝硬化等無關(P>0.05)，這表明KLK7在HCC中呈高表達可能會促進腫瘤侵襲和遷移能力，增加腫瘤的惡性程度。KLK7在HCC中作用的機制同樣可能是對HCC的細胞外基質進行重塑，對細胞黏附分子進行降解，或者通過作為其他細胞的旁分泌因子調節機制從而改變HCC的腫瘤微環境，進而增加HCC的遷移和侵襲能力。

雖然本研究只探討了KLK7在HCC中的表達情況，分析其與臨床病理資料之間的相關性，但對其具體行為機制未作深入探究，仍然有必要進行更大樣本的進一步研究KLK7在HCC中的作用靶點及調控機制，隨著研究的深入,KLK7可能成為HCC潛在的治療靶點或分子標志物。