外周血循環腫瘤細胞聯合細胞角蛋白19片段21-1檢測在非小細胞肺癌篩查中的應用價值

官燕飛，陳健鋒，袁 斌，劉 君，陳 昂，袁春雷，童輝純，陳志強

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占全部肺癌的85%，5年生存率僅為16.10%，位居全球惡性腫瘤死亡率的榜首[1]。2015年中國NSCLC發病例數約50萬，同年，死亡的NSCLC病例則達到40萬，嚴重危害人們生命安全[2]。究其主因是缺乏有效的早期診斷方法，NSCLC確診時70%～80%均為中晚期。國內外學者研究數據證實：I期NSCLC患者5年生存率可達60%～70%，而IV期肺癌生存率則不到5%[3-4]。開展早期篩查是降低NSCLC相關死亡率、顯著提高其5年生存率的關鍵。但是目前尚無公認的NSCLC早期篩查最佳模式。因此，尋找診斷效能高的NSCLC早期篩查方法顯得非常緊迫。該研究通過檢測肺部健康組、良性組及惡性組患者外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)和細胞角蛋白19片段21-1(cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA21-1)水平，比較CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測在三組的陽性率差異及診斷NSCLC的效能差異，綜合評估CTC、CYFRA21-1單獨或聯合診斷NSCLC的價值，為探討一種無創而便捷、敏感又特異的NSCLC篩查手段提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料臨床回顧并通過隨機數字表選取2017年2月～2018年10月中山市博愛醫院、中山大學腫瘤防治中心的172例肺部健康體檢者(健康組)、156例肺部良性病變患者(良性組)、118例NSCLC患者(惡性組)作為研究對象。患者均為原發性肺部病變或腫瘤，未合并其他腫瘤。健康組：男98例，女74例，年齡16.9～86.3(40.6±6.9)歲；良性組：男88例，女68例，年齡21.5～78.9(41.8±5.8)歲；惡性組男68例，女50例，年齡34.6～81.5(42.5±6.3)歲。三組之間的年齡及性別構成比差異均無統計學意義(P>0.05)。

NSCLC的入選參照《2015 版WHO肺部腫瘤組織學分類標準》執行，包括：腺癌、鱗癌、腺鱗癌、大細胞肺癌[5]。NSCLC的TNM分期參照國際肺癌研究協會(IASLC)2017年第8版分期執行，包括：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期[6]。良性組：包括肺良性腫瘤、肺塵埃沉著病、慢性阻塞性肺疾病、肺結核、肺炎等良性病變患者。抽取三組研究病例的靜脈血液標本并檢測CTC與CYFRA21-1水平。CTC和CYFRA21-1聯合檢測采用的是平行試驗，其判斷標準為：兩個檢測結果中只要有一個結果為陽性即診斷為陽性；反之，只有兩個結果均為陰性才診斷為陰性。本研究經我院醫學倫理委員會審查通過，獲得研究對象的知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1主要試劑及儀器 COBAS E601全自動化學發光分析儀及CYFRA21-1檢測試劑盒購自羅氏診斷產品(上海)有限公司，CTC分離富集、檢測試劑盒及PathfinderTM CYTTEL READER and ANALYZER全自動掃描圖像分析系統購自萊爾生物醫藥科技有限公司。

1.2.2CYFRA21-1檢測及判定標準 采用電化學發光方法檢測CYFRA21-1水平，質控品檢測值在設定的范圍內。參考試劑說明書及相關文獻[7]，CYFRA21限值為3.3 ng/ml。CYFRA21≥3.3 ng/ml，提示CYFRA21檢查結果異常。本研究中定為陽性；CYFRA21<3.3 ng/ml，CYFRA21檢查結果正常，本研究中定為陰性。

1.2.3CTC分離富集、檢測及判定標準 陰性富集CTC技術基于免疫學原理，借助免疫磁微粒技術，通過逐步去除血液中的血漿、紅細胞、白細胞等成分，實現血液中CTC的富集。imFISH CTC鑒別技術，將基因水平的FISH技術和蛋白水平的免疫熒光染色技術結合，建立的兼具細胞形態和核遺傳變異的精準CTC鑒別方法。操作流程及判定標準，參考試劑盒及相關文獻[8]：抽取研究對象的靜脈血，ACD抗凝，混勻，血漿分離、紅細胞裂解、白細胞去除、涂片干燥、免疫熒光染色、鏡下觀察。將細胞核內探針信號>2個，無血源性白細胞表面抗原(紅色)陽性的細胞定為CTC。CTC數目≥2個的患者定為CTC陽性患者。

1.3 統計學處理使用SPSS 22.0軟件進行分析。CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測在三組的陽性率差異及診斷NSCLC的效能(靈敏度、特異度、符合率、陽性預測值、陰性預測值)差異的比較采用χ2檢驗。總體差異檢驗水準取α=0.05。三組間進一步做兩兩比較時檢驗水準α′=0.02(0.05/3)。TNM分期的I到Ⅳ期間進一步做兩兩比較時檢驗標水準α″=0.008(0.05/6)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者八號染色體(CEP8)探針信號表達情況熒光顯微鏡下顯示，NSCLC患者CEP8探針信號從0-1個(非CTC，亞二倍體)，2個(二倍體)，3到數個(CTC，超二倍體)不等，染色體數量具有多樣性。圖1中藍色部分為細胞核DAPI染色，橙色部分為探針所在位置。

圖1 NSCLC患者八號染色體(CEP8)探針信號表達情況 ×400

A：未檢測到探針信號(CEP8信號缺失)；B：僅檢測到1個探針信號(CEP8信號缺失)；C：檢測到2個探針信號(二倍體)；D：NSCLC患者CTC(三倍體)；E：NSCLC患者CTC(四倍體)；F：NSCLC患者CTC(五倍體)

2.2 CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測在三組研究對象中陽性率的差異CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測在肺部健康組、良性組與惡性組的陽性率差異均具有統計學意義(P<0.05)，陽性率均在惡性組中最高。進一步做兩兩比較，與健康組與良性組比較，差異均有統計學意義(P<0.02)。見表1。

表1 CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測在三組研究對象中陽性率的比較[n(%)]

2.3 CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測在惡性組各TNM分期中陽性率的比較CTC檢測陽性率在惡性組的各TNM分期中差異具有統計學意義(χ2=9.18，P=0.03)，CTC的陽性率跟惡性組TNM分期相關，隨著分期的增加而增加，在Ⅳ期中最高。CYFRA21-1、CTC聯合CYFRA21-1檢測的陽性率，在不同的TNM分期比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，跟TNM分期無關。見表2。

2.4 CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測診斷NSCLC的效能比較CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測診斷NSCLC靈敏度、特異度、符合率、陽性預測值、陰性預測值總體差異均具有統計學意義(P<0.05)。靈敏度最高的是CTC聯合CYFRA21-1檢測法，與CTC、CYFRA21-1單獨檢測差異均具有統計學意義(P<0.02)。特異度最高的是CTC檢測法，與CYFRA21-1、聯合檢測差異均具有統計學意義(P<0.02)。符合率最高的是CTC檢測法，與CYFRA21-1檢測差異具有統計學意義(P<0.02)。陽性預測值最高的是CTC檢測法，與CYFRA21-1、聯合檢測差異均具有統計學意義(P<0.02)。陰性預測值最高的是CTC聯合CYFRA21-1檢測法，與CYFRA21-1檢測差異具有統計學意義(P<0.02)。約登指數最大的是CTC聯合CYFRA21-1檢測法(達到0.864 5)。見表3。

3 討論

目前NSCLC早期篩查方法是：低劑量CT掃描(LDCT)篩查和血液分子標志物的檢測。研究[9]表明：與普通X線比較，對NSCLC的高危人群進行LDCT篩查可使其死亡率下降20.3%。而傳統腫瘤標志物對早期NSCLC的篩查敏感性和特異性較低[10]。因此，傳統的NSCLC篩查方案也許警示研究人員另辟蹊徑建立一種更為高效的篩查模式顯得日益迫切。

研究[11]證實：CTC的出現可能更優先于影像學能發現更微小病灶。研究[12-13]表明： CYFRA21-1對早期NSCLC輔助診斷中具有一定的臨床意義。但是，CTC聯合CYFRA21-1檢測診斷NSCLC的價值，尚未見報道。

本研究結果顯示CTC、CYFRA21-1、CTC與CYFRA21-1聯合檢測跟肺部病變程度緊密相關。至于研究中CTC出現于肺部良性病變患者中，可能是肺部良性病變(如慢性阻塞性肺疾病患者)發生后，機體處于一種應急狀態，血液中出現了CTC。而CYFRA21-1出現在實驗的良性組患者中，與Holdenrieder et al[14]研究報道的急性肺炎、肺結核患者中該指標明顯升高，容易影響診斷實驗特異性的結論基本一致。

表2 CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測在惡性組各TNM分期中陽性率的比較

表3 CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測診斷NSCLC的效能比較

本研究通過CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測在惡性組各TNM分期中陽性率的比較，可得出一個結論：CTC的陽性率跟惡性組TNM分期是緊密相關的，這一發現可能有助于病情的治療與預后，進而提高NSCLC的生存率。

本研究通過CTC、CYFRA21-1單獨或聯合檢測診斷NSCLC的效能比較，結果顯示，CTC作為一種新型的無創性檢測手段，在區分NSCLC與肺部良性病變，預測惡性組的TNM分期，診斷NSCLC中均有較好的作用。但是，CTC與CYFRA21-1聯合檢測能表現出更佳的綜合性能，可能更有助于減少NSCLC的誤診和漏診，因而建議在臨床診療中進行聯合檢測實用價值更高。

熒光顯微鏡下NSCLC患者CEP8探針信號從0～1個(非CTC)，3到多倍體(CTC)不等。之所以出現這一實驗結果可能跟NSCLC患者腫瘤的基因突變發生方式有關，正常細胞是以染色體二倍體的形式出現(如圖1C)。但是，部分患者發生基因的缺失突變后，染色體畸變為一條甚至為零，圖1A和圖1B即為亞二倍體。而另外部分患者則發生了染色體數目的變化，增加了一條或者數條，圖1D、1E、1F即為超二倍體。總之，當細胞發生異常改變，腫瘤細胞基因發生突變，細胞DNA含量增高或者減低，染色體可以出現三倍體、四倍體，甚至是多倍體。也可以出現染色體丟失的變化。而這種染色體異倍體變化常常優先于腫物的出現。因此，染色體CTC的檢測，有助于對癌變的腫瘤作出早期診斷。

綜上所述， CTC和CYFRA21-1聯合檢測與單獨檢測相比，在NSCLC篩查及分期中擁有較高的綜合性能。這一結論與腫瘤的多因素、多步驟的發生機制吻合。本研究從CTC(染色體角度)和CYFRA21-1(腫瘤標志物角度)兩個不同角度進行聯合檢測，效果高于單個角度。

本研究盡管受到研究時限及樣本容量的限制，初步得到了聯合檢測對NSCLC篩查及臨床分期較有價值的實驗研究結論。后續的研究中我們將在擴大樣本容量的同時，進一步深入探討CTC與CYFRA21-1聯合檢測與NSCLC的耐藥性、轉移復發、療效評估、生存評估等的相關性，或許能對NSCLC的生物學行為及腫瘤機制有更深刻的理解，能進一步促進NSCLC的精準治療，有效地提高NSCLC患者生存率。