hnRNP L在肝癌中的表達及與巨噬細胞極化相關性研究

石 旭，葛勇勝，莢衛東，王 濤，任 超

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤，也是世界上最常見和致命的癌癥之一[1-2]。近年來，研究[3]表明腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)的極化在腫瘤的發生發展中起重要作用，其包括經典的促炎激活M1型和替代的抗炎激活M2型。巨噬細胞極化的失常普遍存在于多種包括HCC在內的惡性腫瘤中，并與腫瘤的生長和轉移密切相關[4-5]。核不均一核糖核蛋白L(heterogeneous-nuclear ribonucleoprotein L，hnRNP L)是一種多功能RNA結合蛋白，在正常組織中微弱表達或不表達，但在多種惡性腫瘤中異常高表達,且與腫瘤進展相關[6-10]。然而，hnRNP L在HCC組織中的表達及其在HCC中的作用機制尚不清楚。有研究[11]表明hnRNP L可能具有調節巨噬細胞極化的潛力，這也可能是其參與肝癌進程的機制之一。該研究將對hnRNP L與肝癌中巨噬細胞極化的關系進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究回顧性收集了90例肝癌石蠟標本，標本來源于2011年1月～2016年12月就診于安徽醫科大學附屬省立醫院肝臟外科并在住院期間行根治性肝癌切除術的患者。術后病理均明確診斷為肝細胞癌。其中男71例，女19例，年齡20～80(51.79±12.51)歲。同時收集了20對新鮮冰凍肝癌組織及相對應癌旁組織(距離腫瘤邊緣至少2 cm)用于后續Western blot及qRT-PCR實驗測定。本研究中所有納入病例手術前未接受放療、化療、靶向治療及介入等抗腫瘤治療。

1.2 主要試劑兔抗人多克隆抗體hnRNP L(北京bioss公司)；鼠抗人多克隆抗體CD68、兔抗人多克隆抗體CD206、兔抗人多克隆抗體CD11c(美國Proteintech Group公司)；DAB顯色試劑盒、蘇木精、通用山羊抗鼠/兔二抗、β-actin(北京中杉金橋公司)；TRIzol試劑、ECL超敏發光試劑盒、逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1免疫組化染色 采用免疫組化SP法檢測hnRNP L及腫瘤相關巨噬細胞標志物(CD68、CD11c、CD206)的表達。制作2 μm厚度的肝癌石蠟組織連續切片。二甲苯脫蠟并在梯度乙醇中進行水化。之后將組織切片置于EDTA抗原修復溶液中進行高壓抗原修復。將切片在3%過氧化氫中孵育20 min阻斷內源過氧化物酶活性。孵育一抗，即添加兔抗人多克隆抗體hnRNP L(稀釋比例為1 ∶200)、鼠抗人多克隆抗體CD68(稀釋比例為1 ∶400)、兔抗人多克隆抗體CD206(稀釋比例為1 ∶100)、兔抗人多克隆抗體CD11c(稀釋比例為1 ∶100)，然后4 ℃下孵育過夜。用PBST溶液沖洗后加入通用型二抗在37 ℃下孵育30 min。PBST洗片后，進行DAB顯色；終止顯色后，蘇木精復染、梯度乙醇脫水、透明、封片及鏡下觀察。免疫組化結果的判定由兩名臨床經驗豐富的病理科醫師雙盲下完成。hnRNP L免疫組化判定標準：400倍顯微鏡下隨機選擇切片組織上5個不重復視野進行免疫組化評分，評分包括染色強度和陽性細胞百分比。染色強度定義如下：棕褐色：3分；棕黃色：2分；淡黃色：1分；著色弱或不著色：0分；陽性細胞百分比即染色細胞占視野內全部細胞的百分比評分，定義如下：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。切片最終評分=著色細胞強度評分×陽性細胞百分比評分。最終評分0分記為陰性，1～3分記為弱陽性，4～6分記為中等強度陽性，9～12分記為強陽性，≥6分者定義為高表達。腫瘤相關巨噬細胞染色判定：400倍鏡下選取5處代表性區域，評估其陽性細胞百分比，取平均值，最后大于平均值即定義為高表達，小于平均值定義為低表達。

1.3.2Western blot 各稱取新鮮冰凍肝癌及癌旁組織100 mg，然后添加1 ml含PMSF的RIPA裂解液勻漿，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液。制配SDS-PAGE凝膠，按照1 ∶4比例添加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水下充分變性。等量上樣后進行電泳。電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜。將PVDF膜置入Western洗滌液內，持續漂洗5 min。添加5%的脫脂奶粉，室溫下水平搖床上緩動封閉2 h。PBST沖洗PVDF膜后添加稀釋后的一抗(兔抗人多克隆抗體hnRNP L稀釋比例為1 ∶500，β-actin抗體稀釋比例為1 ∶1 000)。在4 ℃下緩慢搖動孵育過夜。按照1 ∶10 000比例稀釋HRP標記的二抗在室溫下緩動孵育2 h。PBST洗膜3次。之后進行條帶顯影操作，使用ECL試劑盒檢測蛋白印跡，Image J軟件分析條帶灰度值。內參β-actin蛋白操作參照hnRNP L。

1.3.3qRT-PCR 用TRIzol提取20對新鮮冰凍肝癌和癌旁組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。二步法進行qRT-PCR反應，反應條件為：95 ℃、2 min；95 ℃、5 s；60 ℃、10 s，40個循環。各引物序列如下：hnRNP L正向序列：5′-AGACTCTGGGCTTCCTGAAC-3′，反向序列：5′-TGTCTTCCTGCTCAGATGGG-3′，擴增長度為140 bp；β-actin正向序列：5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，反向序列：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′，擴增長度為96 bp。最后2-ΔΔCt作為hnRNP L mRNA的最終相對表達量。

2 結果

2.1 hnRNP L在肝癌組織中的表達免疫組化結果顯示hnRNP L主要在肝癌及癌旁組織的細胞質中表達，細胞核中偶見表達。其中，hnRNP L在肝癌組織中的陽性表達率為77.7%(72/90)，在癌旁組織中的陽性表達率為53.3%(48/90)，差異有統計學意義(χ2=11.908,P=0.001)，見圖1。qRT-PCR及Western blot實驗結果顯示，在轉錄和翻譯水平，hnRNP L在肝癌組織的表達顯著高于相對應癌旁組織，hnRNP L mRNA在肝癌組織及癌旁組織的相對表達量分別是(1.19±0.51)和(0.61±0.31)，見圖2，hnRNP L在肝癌組織及癌旁組織蛋白的相對表達量分別是(1.09±0.22)和(0.48±0.11)，差異均具有統計學意義(t=5.690，P<0.001；t=15.829，P<0.001)，見圖3。

2.2 hnRNP L在肝癌組織中的表達及臨床病理因素分析臨床病理資料分析結果顯示：hnRNP L在肝癌組織中的高表達與年齡、血管侵犯、腫瘤Edmondson分級及BCLC分期顯著相關，差異有統計學意義(P=0.018、0.039、0.001、0.018)。而與患者其他臨床資料如性別、腫瘤包膜、血清AFP、腫瘤數目、腫瘤大小、肝硬化及HBsAg則未見明顯關系，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 hnRNP L在肝癌組織中的表達與巨噬細胞極化的相關性為了探究hnRNP L在肝癌組織中的表達與巨噬細胞極化的關系，采用了免疫組織化學法對連續切片進行染色，同時Kappa一致性檢驗法分析用于評估二者之間的關系。結果顯示TAMs標記主要在細胞質中表達，染色結果見圖4。hnRNP L的表達強度與CD68(總巨噬細胞Marker)和CD206(M2巨噬細胞Marker)的浸潤密度呈正向的一致性(κ=0.448，P<0.001；κ=0.455，P<0.001)，但與CD11c(M1巨噬細胞Marker)的表達呈負向的一致性(κ=-0.394，P<0.001)(表2)。

圖1 hnRNP L在肝癌及癌旁組織的免疫染色情況

A、C：hnRNP L在HCC組織中的表達；B、D：hnRNP L在癌旁組織中的表達；1、2：病例；A、B：×100；C、D：×400

圖2 hnRNP L在20對HCC組織和癌旁組織中的相對mRNA表達水平與癌旁組織比較：***P<0.001

圖3 Western blot檢測hnRNP L在20對HCC組織和癌旁組織中的表達

A：在4對代表性HCC組織(T)和癌旁組織(P)中hnRNP L蛋白表達條帶；B：20對HCC組織和癌旁組織中hnRNP L蛋白的表達情況；與癌旁組織比較：***P<0.001

表1 hnRNP L在HCC組織中的表達與HCC患者臨床病理因素之間的關系(n=90)

圖4 巨噬細胞極化相關標志物在HCC組織中的免疫組織化學染色 ×400A：總巨噬細胞(CD68)；B:M2巨噬細胞(CD206)；C:M1巨噬細胞(CD11c)

表2 hnRNP L的表達與巨噬細胞極化之間的相關性

3 討論

hnRNP L是一類富含甘氨酸及脯氨酸的RNA結合蛋白，也是一類剪接調節蛋白，其主要調節盒式剪接，對哺乳動物T細胞的發育和功能至關重要[6]。越來越多的研究[7-9]表明hnRNP L在多種惡性腫瘤異常高表達，與腫瘤的發生發展及侵襲轉移密切相關。Goehe et al[8]發現hnRNP L在非小細胞肺癌中顯著高表達，并與外顯子剪接沉默相互作用，調節caspase-9前mRNA的加工，從而影響非小細胞肺癌(NSCLC)的致瘤能力。Zhou et al[7]還發現hnRNP L與前列腺癌侵襲性特征呈正相關性，并且通過影響細胞周期和固有凋亡信號，在前列腺癌中發揮促增殖和抗凋亡作用。Lv et al[9]在敲低膀胱癌細胞中的hnRNP L表達后發現可顯著抑制腫瘤細胞增殖、遷移和上皮間質轉化(EMT)，誘導細胞凋亡和G1-S期阻滯，抑制MAPK信號通路表達調節膀胱癌細胞的命運。Liu et al[12]在胰腺癌的研究中發現hnRNP L作為一種伴侶蛋白協同lncRNA uc.345促進腫瘤進展，并對患者的生存有較好的預測作用。hnRNP L也被發現在口腔鱗狀細胞癌中高表達，Jia et al[13]發現hnRNP L調節致癌剪接因子SRSF3的表達和外顯子4的選擇性剪接，促進腫瘤細胞的增殖和遷移同時參與G2/M細胞周期進程抑制細胞凋亡。Yau et al[10]在HCC中發現hnRNP L自身抗體的高滴度與腫瘤大小增加和生存率降低有關。

基于以往的研究，hnRNP L可能在惡性腫瘤中發揮致癌蛋白的作用。在此研究中，免疫組化、Western blot及qRT-PCR結果顯示hnRNP L在HCC中的表達顯著高于在癌旁組織中的表達。同時臨床資料分析顯示hnRNP L在HCC患者中的高表達與年齡、血管侵犯、Edmondson分級和BCLC分期等不良臨床病理特征顯著相關。關于hnRNP L表達水平的調節，之前的研究[6]表明，hnRNP L可通過激活其自身的毒物外顯子6A復合物來自動調節其在可變剪接水平上的表達，從而介導無義衰變。因此，hnRNP L的異常表達可能與自調節環路失衡有關。但是，詳細機制需要進一步研究。

hnRNP L在腫瘤中的特異性作用機制尚不清楚。以往的研究[7-9,14]表明，hnRNP L能夠調節細胞周期蛋白的表達，同時參與DNA損傷反應的調控，影響腫瘤細胞凋亡。腫瘤在進展中的機制往往是多樣化的，hnRNP L還可能具有調節巨噬細胞極化的作用。既往研究[4]表明M2及M1型巨噬細胞極化的失常與惡性腫瘤密切相關。在HCC主要浸潤于的TAMs是M2型巨噬細胞，并促進腫瘤細胞的增殖、遷移和轉移[5]。此研究初步探討了hnRNP L與巨噬細胞極化之間的關系。結果顯示，在HCC中hnRNP L的表達強度與CD68和CD206的表達強度呈正向的一致性，與CD11c呈負向的一致性。提示hnRNP L可能通過調節TAMs的極化來參與HCC進展。關于其調節通路，可能與PI3K/AKT信號通路有關。Vergadi et al[15]發現PI3K或Akt激酶的激活或過表達是巨噬細胞極化過程中必不可少的重要步驟，同時Akt1的缺失促進M1激活的上調而Akt2的缺失導致M2激活的上調。Klingenberg et al[14]發現hnRNP L可以增強Akt的磷酸化而Akt1是hnRNP L敲低后最顯著調節的因子。上述研究支持了hnRNP L通過PI3K/AKT信號通路參與巨噬細胞極化調節的假設，但是還需要更深入的機制研究。此外，hnRNP L有可能不是單獨起作用，一些研究[11,14]表明hnRNP L作為一種結合蛋白與lncRNA關系密切，兩者通常形成復合物而共同作用。Atianand et al[11]發現lincRNA EPS聯合hnRNP L可以抑制巨噬細胞對LPS介導的天然免疫應答，而其中M1巨噬細胞在應答中發揮重要作用；由lncRNA形成的調節復合物能夠指導巨噬細胞等免疫譜系的發育。因此，lincRNA-EPS與hnRNP L可能共同參與巨噬細胞的極化。但其與hnRNP L在巨噬細胞極化中的關系及其特定的分子機制有待進一步研究。

此研究揭示了hnRNP L在HCC組織中的表達顯著上調，并與HCC的惡性特征相關。此外，HCC中hnRNP L表達水平的增加與巨噬細胞的極化相關。然而，hnRNP L參與HCC發展的特異性分子機制及其對巨噬細胞極化的影響仍需要進一步研究。