金黃色葡萄球菌二元調控系統vraSR基因敲除菌株的構建及其致病性研究

高彩虹，戴媛媛，常文嬌，馬筱玲

金黃色葡萄球菌(以下簡稱金葡菌)是臨床常見的病原菌，能引起從皮膚軟組織感染到菌血癥、肺炎、心內膜炎、深部膿腫等多種感染性疾病[1]。該菌易獲得耐藥性，從臨床標本中分離的金葡菌約50%為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)[2]。萬古霉素是治療嚴重MRSA感染的首選藥物[3]，但隨著臨床用量增加，低水平萬古霉素耐藥金葡菌開始出現，包括萬古霉素中介金葡菌(vancomycin intermediateStaphylococcusaureus，VISA)和異質性萬古霉素中介金葡菌(heterogeneous vancomycin intermediateStaphylococcusaureus，h-VISA)。研究[4]顯示，hVISA/VISA感染的臨床特點為細菌難以清除，感染癥狀持續存在，反復發作，給治療帶來極大困難。

VraSR(Vancomycin resistance-associated sensor regulator)是金葡菌萬古霉素耐藥相關感應二元調控子。研究[5]顯示，VraSR的表達水平在hVISA/VISA中明顯上升。附屬基因調節因子(accessory gene regulator，agr)是金葡菌最重要的全局調控子，對毒力和生物膜均具有調控作用[6]，前期研究[7]結果顯示VraR蛋白可直接與agr啟動子區域結合，提示VraSR可能具有廣泛的調控作用。由此，該研究通過構建萬古霉素異質性耐藥標準菌(Mu3)vraSR基因敲除株、回補株以及小鼠皮膚感染模型，探討VraSR表達在金葡菌致病中發揮的作用，以期為基于VraSR為靶點的hVISA/VISA感染診斷和干預策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、質粒和動物 異質性萬古霉素中介金葡菌(Mu3)和質粒pLI50由安徽醫科大學第一附屬醫院李家斌教授饋贈；金葡菌RN4220為限制性內切酶缺陷菌株；溫度敏感型穿梭質粒pKOR1和大腸桿菌DC10B由皖南醫學院朱濤博士饋贈。昆明小鼠(Kunming mice,KM小鼠)購自安徽醫科大學實驗動物中心，雌性，6～8周齡。

1.1.2主要試劑及儀器 細菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；氯霉素、脫水四環素、溶葡萄球菌素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix購自美國Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；萬古霉素藥物敏感性試紙條購自法國梅里埃公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養基(tryptic soy broth,TSB)、LB培養基購自英國Oxiod公司；Bio-Rad PCR儀、Bio-Rad凝膠成像儀購自美國伯樂公司；ABI7500型熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1引物設計 根據GenBank中金葡菌Mu3基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計vraSR基因上游片段引物(vraSR-UF、vraSR-UR)、下游片段引物(vraSR-DF、vraSR-DR), 所設計的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。見表1。

表1 引物序列

下劃線分別代表attB1和attB2特異性位點；vraSR-UR和vraSR-DF中小寫字母為上下游同源片段之間的互補序列；方框部分為限制性酶切位點

1.2.2金黃色葡萄球菌vraSR基因敲除株的構建 以金黃色葡萄球菌Mu3基因組DNA為模板，以引物vraSR-UF、vraSR-UR和引物vraSR-DF、vraSR-DR分別擴增上下游同源片段，具體引物序列見表1。使用融合PCR得到上下游序列相連的DNA序列。使用Gateway BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix(日本TaKaRa公司)試劑盒進行PCR產物與質粒的重組反應，按試劑盒說明進行操作。通過PCR及測序鑒定重組質粒pKOR1-vraSR是否正確。從大腸桿菌DC10B中抽提的重組質粒pKOR1-vraSR首先電轉入(電轉條件：電壓2.5 kV,電容25 μF,電阻100 Ω)金黃色葡萄球菌RN4220中，從金黃葡萄球菌RN4220抽提的重組質粒以相同條件電轉入金黃色葡萄球菌Mu3后，在42 ℃含10 μg/ml氯霉素的TSB培養基中多次傳代(4～5 次)，將菌液104倍稀釋鋪板到含1 μg/ml脫水四環素(ATc)的TSB平板上，37 ℃培養24 h。挑取50個菌落分別接種普通TSB平板和含10 μg/ml氯霉素的TSB平板，培養過夜。選擇僅在TSB平板上生長的克隆抽提基因組DNA，使用引物vraSR-IF和vraSR-IR進行PCR擴增初步鑒定vraSR基因是否從基因上敲除成功，最后通過序列測定RT-PCR證明敲除株構建成功,敲除株命名為ΔvraSR。

1.2.3金黃色葡萄球菌CΔvraSR基因回補株的構建 首先構建金黃葡萄球菌vraSR基因表達質粒,使用表1中引物vraSR-C-F和vraSR-C-R擴增vraSR基因，使用sac I和Kpn I將vraSR基因克隆到穿梭質粒pLI50，獲得重組質粒pLI50-vraSR。從大腸桿菌E.coliDH5α中抽提的重組質粒首先電轉入金黃葡萄球菌RN4220中，從金黃葡萄球菌RN4220抽提的重組質粒再電轉入ΔvraSR。電轉條件同vraSR基因敲除株的構建，通過序列測定及RT-PCR證明回補成功。

1.2.4實時熒光定量PCR(RT-PCR) 收集對數生長期金葡菌Mu3、ΔvraSR和CΔvraSR。利用TRIzol試劑提取總RNA,按試劑盒操作說明逆轉錄成cDNA,再進行熒光定量PCR檢測。使用的引物序列如下：vraSR-1(F):5′-TGTTGCTCTCAAAAACTGTTCAATA-3′,vraSR-1(R):5′-CCTATTCATATTGGTT-TCGGAA-3′；16sRNA-1(F):5′-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3′，16sRNA-2(R):5′-ATCTACGATTACTAGCGATTCCA-3′。以16sRNA mRNA表達水平作為內參,檢測各菌株中vraSR基因的表達水平。

1.2.5小鼠皮膚膿腫模型的建立 參照文獻[8]報道的方法，將金葡菌Mu3、ΔvraSR和CΔvraSR在37 ℃、220 r/min條件下培養至對數生長中期，收集細菌后用無菌PBS調節菌濃度至1×109CFU/ml,取50 μl金黃色葡萄球菌在小鼠背部進行皮下注射，每一菌株接種5只小鼠，對照組接種50 μl PBS。1周后將小鼠用4%水合氯醛麻醉后解剖觀察并測量小鼠皮膚膿腫面積。

1.2.6平板法統計皮膚組織中的荷菌數 將皮膚組織充分研磨后的組織懸液經適當稀釋涂布于血瓊脂平板上，統計并計算皮膚組織中的荷菌數。

1.2.7石蠟切片的制備 使用皮膚采樣器無菌采集感染后的皮膚組織，置于多聚甲醛固定過夜后，按照常規組織切片的方法制備石蠟切片,并進行HE染色。

2 結果

2.1 Mu3中vraSR基因敲除株ΔvraSR和基因互補株CΔvraSR的構建Mu3與vraSR基因敲除株ΔvraSR基因組DNA以vraSR-IF和vraSR-IR為引物的PCR結果見圖1A，以Mu3為模板，擴增PCR產物長度為1 755 bp，以vraSR基因敲除株DNA為模板，擴增PCR產物長度為100 bp。對vraSR基因敲除株進行回補后，Mu3與vraSR基因回補株CΔvraSR基因組DNA以vraSR-C-F和vraSR-C-R為引物進行PCR擴增(圖1B)， PCR產物長度均為1 662 bp。通過熒光定量分析Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR菌株中vraSR基因的轉錄水平進行了確認，在vraSR基因缺失株中vraSR基因的轉錄完全缺失，對vraSR缺失株的質粒回補回復了vraSR基因的轉錄(t=17.7，P<0.001)(圖1C)。以上結果均證明vraSR基因被敲除及回補成功。

圖1 構建金黃色葡萄球菌vraSR基因敲除株及回補株

A：用PCR方法篩選vraSR基因敲除株；B：用PCR方法篩選vraSR基因回補株；M：2 000 bp DNA Marker；WT：野生株Mu3；2和3：CΔvraSR菌株；C：RT-PCR檢測Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR菌株中vraSR基因的mRNA表達水平；與ΔvraSR比較：***P<0.001

2.2 敲除vraSR基因降低金葡菌的致病性與Mu3菌株比較，ΔvraSR菌株接種小鼠后肉眼觀察皮膚病變較輕，Mu3和ΔvraSR菌株的膿腫面積分別為(1.58±0.31)cm2、(0.71±0.15)cm2(t=5.634，P<0.001)。CΔvraSR株形成膿腫面積為(1.15±0.30)cm2(t=2.864,P<0.05)，表明回補vraSR基因后增加金葡菌致病性(圖2A、2B)。另外，通過分析小鼠皮膚組織的菌負荷量顯示，ΔvraSR株接種小鼠皮膚組織菌負荷量也顯著減少(t=3.356,P<0.01)。回補vraSR基因后小鼠皮膚組織菌負荷量增加(t=2.521,P<0.05)(圖2C)。取小鼠皮膚組織進行HE染色觀察顯示Mu3感染組小鼠皮膚組織病理損傷明顯加重，主要表現為顯著的炎性細胞浸潤；而ΔvraSR感染組小鼠皮膚組織病理損傷較輕，未發現明顯的炎性細胞浸潤。以上結果表明，Mu3菌株中vraSR基因缺失可以明顯降低金黃色葡萄球菌的致病性。

3 討論

二元調控系統(two-component regulatory system，TCRS)是細菌中常見的信號轉導系統，也是基因表達的重要調控系統。細菌可以利用TCRS調節毒力、代謝、營養等一系列生理過程，從而協助其適應外界環境，在細菌的致病性中發揮重要作用[9]。VraSR是一種與萬古霉素耐藥相關的二元調控系統，在VISA/hVISA中高表達[5]。然而，目前對VraSR的研究均集中在耐藥調控方面，其在金葡菌致病性中的作用尚未見報道。

本課題組采用pKOR1和 pLI50為載體，分別構建金葡菌vraSR基因敲除株及其回補株，并利用RT-PCR驗證構建成功。pKOR1質粒的結構特點是有用于lambda重組的位點(attP1、attP2)，可快速構建同源重組質粒，無需人為導入抗生素抗性基因，可避免影響其他基因功能。質粒pKOR1的另一個特點是在脫水四環素誘導條件下可表達secY的反義RNA,secY是葡萄球菌的必須基因，因此整合了該質粒的菌株將無法存活[10]。由于以上特點，采用質粒pKOR1可以極大地提高目的基因的敲除效率。

VraSR是萬古霉素耐藥相關二元調控系統,由組氨酸激酶VraS和反應調控蛋白VraR兩個部分組成。研究[11]顯示VraSR可感受外界壓力變化,參與細胞壁調節。細胞壁是包被于細菌細胞最外側具有堅韌性和彈性的復雜結構。金葡菌細胞壁的主要成分包括肽聚糖、脂磷壁酸、壁磷壁酸及脂蛋白。這些胞壁成分常在宿主免疫系統針對金葡菌感染產生多種趨化因子和細胞因子的過程中發揮作用。有研究[12]顯示缺乏壁磷壁酸的菌株對內皮細胞的吸附性明顯降低，與動物心內膜炎模型中金葡菌毒力降低有關。另有報道稱脂磷壁酸能夠激發中性粒細胞釋放細胞因子[13]，而肽聚糖與脂磷壁酸協同作用可在體內引發炎癥反應[14]。研究[11]顯示vraSR在保持細胞壁肽聚糖完整性上發揮重要作用, 缺失vraSR基因的菌株細胞壁合成能力明顯降低。本實驗通過HE染色檢測小鼠皮膚組織病理變化，結果表明，ΔvraSR感染組小鼠皮膚組織炎性浸潤顯著降低。

圖2 小鼠皮膚膿腫形成

A：小鼠皮膚感染大體標本；B：小鼠膿腫面積大小；C：小鼠皮膚組織菌負荷量；與ΔvraSR比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；D：各組小鼠皮膚組織HE染色；a：生理鹽水組；b：Mu3菌株組；c：ΔvraSR菌株組；d：CΔvraSR菌株組；1：×2；2：×40

本課題組前期研究[7]表明VraR蛋白可以直接與agr啟動子區域結合。agr是金葡菌中研究最多也最為透徹的二元調控系統，可調節胞外蛋白毒素及細胞表面相關蛋白的表達[6]。agr調控可以使金葡菌從感染的定植階段向感染后期入侵、獲取宿主營養物質階段過渡[15]。由此推測VraSR可能通過agr間接參與金葡菌毒力調控。毒力是決定細菌致病力的關鍵因素。本研究采用小鼠皮膚膿腫模型證實敲除vraSR基因后，金葡菌的致病性顯著下降。

綜上所述，敲除金葡菌vraSR基因可以明顯降低金葡菌皮膚膿腫的形成及炎癥反應，證實VraSR在金葡菌的致病性中發揮重要作用。VraSR通過何種途徑調節金葡菌致病性，其機制是否與agr調控系統及細胞壁合成相關需進一步深入研究。