CNV-Seq在高齡孕婦產前診斷中的應用

汪 菁，徐晶晶，陳 玲，劉 文，宋雅嫻，胡 月，彭亞琴，吳麗敏，公顏平，于 婷

隨著DNA測序技術的發展，更多基于測序的分子診斷方法越來越成熟，基于高通量測序的基因組拷貝數變異(CNV-Seq)是其中一種新興的應用于產前診斷的檢測方法，有助于檢測出染色體的微缺失和微重復，提高染色體異常檢出率。現對進行產前診斷的高齡孕婦羊水樣本同時進行染色體G帶核型分析和CNV-Seq檢測，對該檢測數據進行回顧性分析，旨在探討CNV-Seq是否能夠有效提高高齡孕婦染色體異常檢出率，從而達到降低高齡妊娠出生缺陷率的目的。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018年1～8月在中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)產前診斷中心進行產前診斷的80例孕周為18周+3～28周、年齡為35～45歲的高齡孕婦，通過羊膜腔穿刺術獲取羊水樣本80份，同時進行染色體G顯帶核型分析和CNV-Seq檢測，孕婦簽署產前診斷和CNV-Seq知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1羊膜腔穿刺 孕婦在B超引導下，由具有產前診斷資質的醫師行羊膜腔穿刺術，每個孕婦抽取3管羊水，每管10 ml，共30 ml羊水，其中2管羊水進行細胞培養，供染色體核型分析，剩余1管進行CNV-Seq檢測。

1.2.2染色體G顯帶核型分析 抽取20 ml羊水進行細胞接種，每個孕婦的樣本進行兩線培養，培養至7 d左右顯微鏡下觀察細胞狀態，換液培養，1～2 d后進行細胞收獲、染色制片、核型分析。

1.2.3CNV-Seq檢測 抽取10 ml羊水，樣本由華大基因公司完成CNV-Seq，該檢測針對染色體非整倍體變異和100 kb以上的CNV，其方法如下：使用DNAeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)從羊水細胞中分離基因組DNA，使用50 ng基因組DNA作為起始模板，構建測序文庫，最后在BGISEQ-500測序儀上進行測序。使用Burrows-Wheeler Aligner(Version0.7.7)比對軟件將讀序信息與人類參考基因組(GRCh37,UCSC release hg19)進行比對、分析得到生物信息學結果，判斷是否存在染色體非整倍體變異和CNV，并通過ISCA、Decipher、Clinvar等數據庫查詢，對檢測到的CNV的致病性進行評估。

1.3 隨訪對所有孕婦進行電話隨訪，追蹤妊娠結局及新生兒健康狀況。

2 結果

2.1 染色體G顯帶核型分析結果本研究對80例高齡孕婦同時進行了羊水細胞染色體核型分析和羊水CNV-Seq檢測，染色體核型分析檢測出13例異常核型，其中21三體6例，18三體3例，性染色體非整倍體異常2例(1例是47,XXX，1例是47,XXY)，低比例嵌合2例(46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]；47,XN,+2[10]/46,XN[120])，染色體異常檢出率為16.25%，致病性異常檢出率為13.75%。見表1。

2.2 CNV-Seq檢測結果CNV-Seq檢測結果致病性染色體異常例數14例，異常檢出率17.5%，其中21三體6例，18三體3例，性染色體非整倍體異常2例(1例是47,XXX，1例是47,XXY)，明確致病性染色體微缺失2例，可能致病性染色體微缺失1例，臨床意義未明的染色體微缺失、微重復 39例，致病性染色體異常檢出率為17.5%，在染色體G顯帶核型分析結果基礎上致病性染色體異常檢出率增加了3.75%。

2.3 染色體G顯帶核型分析聯合CNV-Seq檢測結果染色體G顯帶核型分析聯合CNV-Seq檢測的致病性異常例數為14例，致病性異常檢出率為17.5%，比單一的染色體G顯帶核型分析高出3.75%。染色體G顯帶核型分析比CNV-Seq檢測額外檢出了2例小于10%的低比例嵌合(46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]；47,XN,+2[10]/46,XN[120])，CNV-Seq檢測比染色體G顯帶核型分析額外檢出了2例明確致病性染色體微缺失和1例可能致病性染色體微缺失(表2)，兩種方法對于其他染色體非整倍體異常的檢出結果一致。

表1 染色體核型異常結果及其相應CNV-Seq結果

*為染色體核型低比例嵌合病例

表2 致病性染色體微缺失結果

2.4 隨訪結果對所有高齡孕婦進行產后電話隨訪，11例致病性染色體異常患者已進行引產；2例染色體非整倍體異常孕婦已足月分娩，其中1例為47,XXX，足月分娩，尚未見明顯異常，1例為47,XN,+21，足月分娩(孕婦強烈要求保留胎兒)，胎兒出生后已出現心臟異常；1例疑似致病染色體16p11.1p11.2微缺失，已足月分娩，未見明顯異常；2例低比例嵌合，足月分娩，未見明顯異常。

3 討論

CNV-Seq是一項基于高通量測序技術的基因組拷貝數變異檢測，可通過測序深度的調整，改變分辨率，檢測不同大小的CNV，本研究中所用的方法分辨率為100 kb，該方法可很好的彌補核型分析分辨率低的不足。CNV-Seq的優勢主要有檢測范圍廣、高通量、周期短、分辨率高、操作簡便、低DNA樣本量[1]，并且已有很多研究者對該方法的適用性進行評估，Wang et al[2]報道該技術相較于核型分析對致病性或可能致病性的檢出率由1.8%提高至2.8%，有很好的可靠性和準確性。本研究對80例高齡孕婦的羊水樣本同時進行了CNV-Seq和核型分析，致病性異常14例，檢出率為17.5%，致病性染色體非整倍體異常11例，包括21三體6例，18三體3例，性染色體非整倍體異常2例，致病性染色體微缺失3例(明確致病的染色體微缺失2例，可能致病的染色體微缺失1例)。CNV-Seq和核型分析均檢測出致病性染色體非整倍體異常，但3例致病性染色體微缺失，均未在核型分析時被檢測到。該結果表明對高齡孕婦實施產前診斷非常必要，并且應用CNV-Seq能明顯增加致病性染色體微缺失、微重復的檢出率。染色體微缺失、微重復會導致一些復雜臨床表型(如生長發育異常、智力發育遲緩、內臟器官畸形、內分泌異常等)的綜合征發生，是染色體疾病中的常見類型，目前已發現67余種染色體微缺失、微重復綜合征，發病率約在1/4 000～1/50 000[3]。通過本研究證實CNV-Seq是檢測該種染色體畸變的有效方法，因此對高齡孕婦的產前診斷聯合應用核型分析和CNV-Seq有很重要的臨床意義。

對3例核型分析未檢測到的致病性染色體微缺失結果分析如下：① 致病性染色體微缺失病例1：Y染色體長臂部分(24,026,787～26,227,153)片段缺失一個拷貝，長約2.20 Mb，為已知致病突變。該區域包含于“Spermatogenic failure, Y-linked”報道區域內，并且覆蓋該病相關的“AZFc region”的主要基因BPY2、DAZ、CDY1等，Y染色體AZFc區域缺失是導致男性生精障礙最常見的原因。"Spermatogenic failure, Y-linked”的主要臨床特征為無精癥、輕度至嚴重少精癥，從而導致男性不育。個體間臨床表征具有差異性。阿周存 等[4]2006年報道，對128例嚴重寡精癥患者和287個正常生精男性的DAZ基因缺失進行研究，發現DAZ1/DAZ2/DAZ3/DAZ4缺失僅見于嚴重寡精癥患者，頻率為11.7%；DAZ1/DAZ2缺失的頻率在嚴重寡精癥患者中顯著高于正常男性(9.4%vs2.8%,P=0.004)；這些結果提示DAZ基因全部拷貝缺失是嚴重寡精癥患者生精障礙的常見遺傳病因，而DAZ1/DAZ2缺失則可能是一種高風險因素。該孕婦已進行引產。② 致病性染色體微缺失病例2：X染色體短臂部分(6,427,993～8,147,809)片段缺失一個拷貝，長約1.72 Mb，為已知致病變異。該區域包含OMIM收錄的致病基因STS，STS基因功能異常關聯疾病“Ichthyosis, X-linked”。多篇文獻[5-7]報道，在X-linked ichthyosis患者中檢出STS基因部分或全基因缺失突變。“Ichthyosis, X-linked”的臨床表現包括：眼角膜混濁，視力通常不受影響；魚鱗病，皮損通常對稱發生，主要發生在四肢、頭皮、頸部和軀干上，呈棕色；男性隱睪，睪丸癌風險增加；產前表現為晚產；出生后1年內發病，大部分(80%～90%)由STS基因缺失導致，男性發病率為1 ∶6 000[8-9]。該病呈X連鎖隱性遺傳，本送檢樣本檢出STS基因缺失一個拷貝，由于該孕婦胎兒為男性，則會導致疾病的發生。該孕婦已進行引產。③ 可能致病性染色體微缺失病例3：16號染色體短臂部分(34,214,421～35,180,066)片段缺失一個拷貝，長約965.64 kb，為疑似致病變異。據Molck et al[10]報道，在1例表型為動脈閉鎖、室間隔缺損和肺動脈閉鎖缺陷的患者中檢出了16p11.1p11.2區域的缺失變異，長約961 kb，該區域包含基因UBE2MP1、LOC146481、LOC100130700、RN5S411和FLJ26245。本次檢出變異與文獻報道變異相近，為疑似致病變異。電話隨訪，該孕婦足月分娩，目前未發現明顯異常，將繼續對其隨訪了解其遠期預后。

本研究中有2例核型分析檢出的10%以下低比例嵌合異常未能通過CNV-Seq檢測到，此案例一方面反映了CNV-Seq的不足，但另一方面也能在未實施其他方法復查的情況下通過CNV-Seq印證該羊水細胞嵌合比例低于10%。臨床建議這2例孕婦去其他醫院通過FISH復查，但孕婦拒絕。羊水培養中很容易出現假性嵌合，羊水中假性嵌合體大多為兩條染色體的易位、一條染色體的丟失、標記染色體、一條染色體的增加和染色體部分三體等，大部分妊娠結局良好[11]。該兩例嵌合，1例為46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]，另1例為47,XN,+2[10]/46,XN[120]，嵌合比例較低，并且比較符合羊水假性嵌合體，在孕婦未通過其他方法驗證的情況下，B超監測并隨訪，該2例孕婦均已足月分娩，未發現異常。

通過此項研究發現高齡與染色體異常密切相關，并且該染色體異常不僅包括非整倍體染色體異常，也包括染色體的微缺失和微重復。因此在對高齡孕婦實施產前診斷時，聯合核型分析和CNV-Seq檢測將有效提高致病性檢出率，降低出生缺陷，為臨床的產前咨詢提供有效可靠的依據。