支氣管哮喘患者的血清分泌型卷曲相關蛋白5與其氣道炎癥的相關性分析

廖正壽 陳東華 魯潛乾 張志軍 羅小春

深圳市寶安區沙井人民醫院急診科518104

支氣管哮喘(哮喘)是常見的呼吸道慢性炎性疾病之一，對其發病機制尚未完全闡明，主要表現為在發病時由肥大細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞等多種細胞參與的氣道炎癥[1-2]。其易感者主要表現為反復咳嗽、喘息和/或氣促等癥狀，大部分在夜間或早晨發生，癥狀可自行或經治療后緩解[3]。目前全世界約有一億哮喘患者，我國哮喘的患病率約為1%，其中兒童可達3%，已成為嚴重威脅公眾健康的一種慢性疾病[4-5]。因哮喘是一種氣道炎癥，故監測氣道炎癥對其診斷、治療及預后評估具有重要意義。分泌型卷曲相關蛋白5(secreted frizzled-related protein 5，SFRP5)是一種由脂肪細胞分泌的抗炎因子，可通過Wnt信號通路介導轉化生子因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和IL-13等炎性因子的低表達來實現抗炎作用[6]。研究發現，“細胞炎性因子網絡失衡”在哮喘的發病過程中發揮重要作用，TGF-β1、IL-13和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是主要的炎性因子，可能參與了哮喘發作[7]。目前，SFRP5與哮喘的關系尚不清楚，我們推測，SFRP5可能在巨噬細胞參與下發揮抗炎作用。因此，本研究通過觀察哮喘SFRP5水平的變化及分析與氣道炎癥的關系，初步探討SFRP5在哮喘疾病發生、發展過程中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年11月至2018年9月在廣東省深圳市寶安區沙井人民醫院診治的哮喘患者96例，年齡(40.15±9.35)歲，年齡范圍為20～63歲；其中將哮喘急性發作48例作為急性組，男34例，女14例，年齡(39.85±9.21)歲，年齡范圍為20～62歲；將哮喘緩解者48例作為緩解組，男36例，女12例，年齡(40.46±9.52)歲，年齡范圍為22～63；選擇同時期在廣東省深圳市寶安區沙井人民醫院進行健康體檢者48例作為正常對照組，男32例，女16例，年齡(41.03±10.51)歲，年齡范圍為22～60歲。3組患者基線水平具有可比性。又將急性組分為輕度急性組28例和中重度急性組20例。所有患者均按照《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》[8]進行治療。病例入選標準：(1)哮喘診斷符合《支氣管哮喘防治指南》(2016年版)；(2)能完成肺功能檢查；(3)納入試驗前6周沒有接受激素或抗生素治療；(4)征得研究對象及家屬知情同意，簽署知情同意書。病例排除標準：(1)有支氣管擴張、COPD、肺結核等肺部結構性改變；(2)患有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、糖尿病等疾病；(3)患有急慢性肝腎疾病；(4)患有神經精神系統疾病或其他系統感染性疾病。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準(倫審2016-13號)。

1.2 樣本采集和生化指標的檢測

1.2.1 樣本采集 采集受試者清晨空腹靜脈血5 ml，用枸櫞酸鈉抗凝，離心分離血清，分裝后-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 血清指標檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)法(試劑盒購于中國上海酶聯生物科技有限公司)檢測血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平。將相應一抗稀釋至10 mg/L，加入到96孔板中，0.1 ml/孔，4℃過夜，洗滌3次，加血清0.1 ml于上述反應孔中，37℃孵育1 h；加入新配置相對應的二抗0.1 ml，孵育1 h；加入新配置的3，3′，5，5′-四甲 基 聯 苯 胺(TMB)底 物 溶 液0.1 ml，顯色20 min；加入2 mol/L硫酸0.05 ml終止反應，于450 nm處測各孔吸光度(A)值。

1.2.3 肺功能檢測 測定第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(forced expiratory volume in one second as a percentage of expected value，FEV1%pred)、FVC，FEV1/FVC。

1.3 統計學分析 用SPSS 21.0對數據進行錄入、統計學分析。實驗結果采用±s，采用t檢驗和單因素方差分析進行判斷，多重比較采用SNK-q檢驗；相關分析采用Pearson積差相關，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組人群血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的比較 緩解組和急性組SFRP5、FEV1%pred和FEV1/FVC均低于對照組，差異有統計學意義(F=38.24、5.81、3.54，P值均＜0.05)；急性組SFRP5、FEV1%pred和FEV1/FVC均低于緩解組，差異有統計學意義(t=9.842、25.199、6.265，P值均＜0.05)；緩解組和急性組TGF-β1、IL-13和TNF-α水平均高于對照組，差異有統計學意義(F=41.53、8.37、63.84，P值均＜0.05)；急性組TGF-β1、IL-13和TNF-α水平均高于緩解組，差異有統計學意義(t=15.365、16.236、19.040，P值均＜0.05)。見表1。

2.2 病情嚴重程度對血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的影響 中重度急性組SFRP5、FEV1%pred和FEV1/FVC均低于輕度急性組，差異有統計學意義(t=3.96、30.62、24.96，P值均＜0.05)；中重度急性組TGF-β1、IL-13和TNF-α水平均高于輕度急性組，差異有統計學意義(t=5.08、7.47、9.58，P值均＜0.05)。見表2。

2.3 哮喘患者血清中SFRP5水平與TGF-β1、IL-13、TNF-α水平、肺功能及病情的相關性分析 哮喘患者血清中SFRP5水平與TGF-β1、IL-13和TNF-α呈負相關，差異有統計學意義(r=-0.459、-0.518、-0.642，P值均＜0.05)；與FEV1%pred、FEV1/FVC和病情呈正相關，差異有統計學意義(r=0.452、0.4788、0.472，P值均＜0.05)。見表3。

3 討論

哮喘是由免疫損傷引起，細胞因子的種類決定其發展和轉歸。研究證實，炎癥既參與氣道炎癥，也決定了肺功能的轉歸，TGF-β1、IL-13、CRP三者參與了哮喘的發病過程[9]。TGF-β1兼具抗炎和促進炎癥作用，可以延長Th2細胞的存活期而增加IL-13、IL-4等細胞因子，同時也能抑制Th2細胞的活性減少IL-13的作用，但促進IL-13增加的作用遠大于其抑制作用，引起血清中IL-13水平升高，對氣道炎癥的形成及加重發揮調節作用[10-11]。IL-13是由Th2細胞分泌、具有多種功能的細胞因子。目前，IL-13被認為是引起哮喘發病的關鍵細胞因子，是哮喘發病的中心環節。主要表現在兩方面，首先，IL-13通過激活嗜酸粒細胞，促進IgE的生成和釋放，誘發氣道高反應性；其次，IL-13能直接刺激成纖維細胞的增殖及活化，引起氣道變窄及呼吸道重塑[12]。IL-13可以單獨作用引起哮喘發作，通過哮喘模型，在小鼠體內預先注入一定量的anti-IL-13，發現氣道炎癥明顯減少，小鼠哮喘癥狀也減輕[13]。TNF-α主要由單核巨噬細胞分泌，其水平增加可激活核因子-κB下游的其他細胞因子，增強細胞內炎癥信號的強度[14]。本研究結果顯示，當發生哮喘時，血清中TGF-β1、IL-13、TNF-α水平顯著增高，并與病情嚴重程度有關。

表1 3組人群血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的比較(±s)

表1 3組人群血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的比較(±s)

注：SFRP5為分泌型卷曲相關蛋白5；TGF-β1為轉化生子因子β1；TNF-α為腫瘤壞死因子α；FEV 1%pred為第1秒用力呼氣容積占預計值百分比；與對照組比較，a P＜0.05

組別 例數 SFRP5(μg/L)TGF-β1(ng/L)IL-13(ng/L) TNF-α(ng/L)FEV 1%pred(%)FEV 1/FVC(%)對照組 48 13.42±1.63 311.94±30.42 21.68±2.78 98.47±14.36 91.34±5.37 85.47±3.15緩解組 48 9.78±1.60a 479.52±71.46a 42.73±8.19a 221.83±52.16a 85.73±6.30a 73.72±4.69a急性組 48 6.39±0.51a 734.71±90.19a 69.25±7.81a 438.25±59.00a 50.41±7.39a 65.95±7.20a F值 38.24 41.53 8.37 63.84 5.81 3.54 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.01 0.03

表2 病情嚴重程度對血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的影響(±s)

表2 病情嚴重程度對血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的影響(±s)

注：SFRP5為分泌型卷曲相關蛋白5；TGF-β1為轉化生子因子β1；TNF-α為腫瘤壞死因子α；FEV 1%pred為第1秒用力呼氣容積占預計值百分比；與輕度急性組比較，a P＜0.05

組別 例數 SFRP5(μg/L)TGF-β1(ng/L)IL-13(ng/L) TNF-α(ng/L)FEV 1%pred(%)FEV 1/FVC(%)輕度急性組 28 7.35±0.80 679.52±59.63 61.66±7.48 318.83±52.70 64.70±8.53 70.55±6.36中重度急性組20 5.38±0.41a 850.52±95.62a 84.64±9.05a 562.98±63.91a 45.82±5.51a 52.89±9.47a t值 3.96 5.08 7.47 9.58 30.62 24.96 P值 0.02 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 哮喘患者血清中SFRP5水平與TGF-β1、IL-13、TNF-α水平、肺功能及病情的相關性分析

SFRP5是SFRP家族中的一員，SFRP5基因定位于人染色體10q24.1上，含有一個細胞外富含半胱氨酸結構域(cysteine-rich domain，CRD)，該結構域與Wnt信號通路的跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled，Frz)的CRD具有高度的同源性，與Frz競爭性結合Wnt配體，抑制Wnt信號通路[15]。Wnt信號通路通過調控T細胞、B細胞及巨噬細胞等多種免疫細胞的分化與發育，在機體免疫應答過程中發揮重要作用[16]。SFRP5廣泛表達于脂肪和肺等組織，通過抑制脂肪組織中巨噬細胞分泌促炎因子如TNF-α和IL-13等，而發揮抗炎功能[17]。研究發現，人體內Wnt由脂肪組織中的巨噬細胞表達，作為促炎分子參與了炎癥的發生、發展過程[18]。SFRP5是Wnt的抑制劑，通過抑制非經典Wnt通路的下游靶點c-Jun氨基末端激酶-1(c-Jun N-terminal kinases-1，JNK-1)的活性，減少炎癥因子的分泌。在對風濕性關節炎患者的研究中發現，SFRP5通過下調JNK-1，可以抑制IL-6和IL-1β釋放[19]。在高脂喂養條件下，SFRP5基因缺陷小鼠TNF-α和IL-1β水平顯著高于野生型小鼠，同時，白色脂肪組織中JNK-1的磷酸化以及JNK-1下游底物c-Jun的磷酸化均明顯提高[20]。提示SFRP5基因沉默可以活化JNK-1，增加TNF-α和IL-1β水平，解除SFRP5對Wnt-JNK信號通路的抑制作用，產生炎癥作用。本研究結果顯示，緩解組和急性組SFRP5、FEV1%pred和FEV1/FVC均低于對照組，且急性組SFRP5低于緩解組；中重度急性組SFRP5低于輕度急性組；哮喘患者血清中SFRP5水平與TGF-β1、IL-13和TNF-α呈負相關；與FEV1%pred、FEV1/FVC和病情呈正相關。

綜上所述，SFRP5與氣道炎癥呈負相關，與肺功能和病情呈正相關，SFRP5作為一種抗炎因子，對哮喘患者病情嚴重程度及預后判斷、治療具有重要意義。通過沉默SFRP5基因可能為哮喘的治療提供一個新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突