順鉑-聚己內酯微球的研制及其緩釋性能測試

林愛珠，方 芳，吳宏霞，劉天惠，柯 方，林 媚

順鉑是一種強效抗癌藥物，是治療胃腸道癌癥和婦科癌癥最有效的藥物[1]，同時也是當前聯合化療中最常用的藥物之一[2]。目前，臨床上常用的順鉑劑型有粉針劑、凍干劑、注射劑3種類型。由于注射后，順鉑轉移進入血液循環的速度快，在癌組織中停留時間很短，很難達到高效、長效的抗癌作用[3-5]。順鉑與其他抗腫瘤藥物一樣，容易產生腎毒性、骨髓抑制、惡心、嘔吐等不良反應。因此，雖然自1969年就已報道順鉑對腫瘤具有強抑制作用，但其劑型仍有待改善以滿足臨床的需求。聚己內酯(polycaprolactone，PCL)是生物可降解材料，可使藥物持續釋放數月，是一種性能優良的緩釋藥物載體材料[6]。將順鉑制成PCL微球，可用于腫瘤的栓塞治療，使腫瘤區的藥物濃度長時間維持在較高水平，降低體循環的藥物濃度，提高療效，降低毒副作用。目前，順鉑微球制劑存在載藥率低等缺點，限制其在臨床的應用，制備載藥率較高的順鉑微球對栓塞微球實現個體化治療有一定的促進意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 PCL(數均分子量分別為7×104，16.5×104，英國Sigma試劑有限公司)；順鉑(65%Pt，上海麥克林生化有限公司)；聚乙烯醇(PVA，醇解度87.0～89.0 mol%，黏度20.5～24.5 mPa·s，上海阿拉丁試劑有限公司)；二氯甲烷(DCM)；N，N二甲基甲酰胺(DMF)；二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC)均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；透析袋(截留分子量2 000，上海生工生物工程有限公司)。

1.1.2儀器 電子天平(HZK-FA110，福州華志科學儀器有限公司)；超聲儀(KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限有司)；紫外分光光度計(UV-2450，上海島津國際貿易公司)；精密增力電動攪拌器(JJ-1)及恒溫振蕩器(SHA-B)(常州國華儀器有限公司)；鎢燈掃描電子顯微鏡(Quanta 250，美國FEI公司)；XRD衍射儀(DY5261/Xpert3型，美國CEM公司)；偏光顯微鏡(XP-330C，上海蔡康光學儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1順鉑微球的制備 采用水包油(O/W)與溶劑揮發相結合的方法制備負載順鉑的PCL微球。準確稱取0.180 g PCL，溶于一定量的DCM中后，加入0.018 g順鉑，在超聲儀中超聲1 min形成均一分散相，然后將此溶液逐滴加到50 mL PVA水溶液中，分散乳化。其中PVA濃度為1.0%～3.5%，分散攪拌速度為500～1 000 r/min。在磁力攪拌下使殘余的有機溶劑DCM揮發，固化成球。制得一系列微球(標記為A1～A6及B1～B3，A系列是分子量為16.5萬PCL制得的微球，B系列是分子量為7萬PCL制得的微球)。

1.2.2載藥量和包封率的測定 由于順鉑是以固體的形式包含于PCL，需將順鉑全部溶出，再測定其含量，故繪制順鉑-DMF標準曲線來測定其載藥率和包封率：精密稱取0.01 g順鉑，用DMF配置成2.000 mg/mL的標準溶液，隨后用DMF稀釋成一系列濃度(0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8及1.0 mg/mL)，以DMF液為空白溶液，于紫外光譜儀310 nm處測吸光度，以濃度對吸光度作標準曲線，從回歸方程(1)可知，在0.01～1.0 mg/mL范圍內，標準曲線線性關系良好。取20 mg干燥后的微球，溶于2 mL的DMF，定容。于310 nm處測吸光度，根據回歸方程(1)計算出順鉑的含量，并計算載藥率和包封率。

A=0.564 2C+0.002

(1)

(R2=0.9994，其中C為順鉑在介質中的濃度，A為吸光度，R2為相關系數)

1.2.4載藥微球中藥物的存在形式 取適量樣品，用紅外壓片機壓片，再把樣品轉移到特制的載玻片上，采用X射線衍射法考察順鉑在微球中的結構。儀器參數：掃描范圍2θ=5°～70°，掃描速度4°/min。

1.2.5微球的體外釋放測試 順鉑-DDTC標準曲線的繪制[7]：精密稱取0.01 g的順鉑，用0.9%生理鹽水配置成1.000 mg/mL的標準溶液，隨后用0.9%生理鹽水稀釋成一系列濃度(0.1，0.5，1.0，10.0，15.0，25.0，50.0及100.0 μg/mL)，然后各取1.00 mL，分別加入10%堿性DDTC溶液1.00 mL，沸水浴加熱10 min使順鉑與DDTC形成螯合物，冷卻后加入5 mL氯仿，37 ℃恒溫振蕩10 min，2 000 r/min離心10 min，分離氯仿層，以氯仿為空白溶液，于347 nm處測吸光度，以濃度對吸光度作標準曲線，從回歸方程(2)可知，在0.1～100 μg/mL范圍內，標準曲線線性關系良好。準確稱取順鉑微球30 mg，并量取5 mL 0.9%的NaCl溶液加入透析袋中(截留分子量2 000)，然后將透析袋放入15 mL的0.9%的NaCl溶液中，在避光條件下，于37 ℃恒溫振蕩器往復振蕩，每隔一段時間取出所有釋放介質，并替換新鮮等量的0.9%的NaCl溶液。取所釋放溶液1 mL按上述方法進行螯合處理，以氯仿為空白溶液，于347 nm處測吸光度，根據方程(2)計算出微球順鉑釋放量。

A=0.011 7C+0.003 4

(2)

(R2=0.999 3，其中C為順鉑-DDTC螯合物在介質中的濃度，A為吸光度，R2為相關系數)

2 結 果

2.1PVA濃度及PCL分子量對微球載藥率及包封率的影響 按表1設計的乳化條件制得微球并測定載藥率及包封率。在其他條件相同時，高分子量的PCL制得微球的載藥率和包封率均高于低分子量PCL制得的微球，且無論PCL分子量的高低，載藥率都隨著PVA濃度的增大而減小。當PVA濃度較低時，分子量大的PCL包載藥物乳化成球過程中，有少部分PCL未能成球，形成絮狀物。

表1 不同PCL分子量和PVA濃度條件下的微球載藥率和包封率

2.2攪拌速度對微球載藥率及包封率的影響 基于表1中分子量為16.5萬的聚合物的載藥率及包封率較高，選用該分子量的PCL為載體，研究攪拌速度對微球載藥率和包封率的影響，結果見表2。當其他變量固定時，載藥率隨著攪拌速度增大而降低，而藥物的包封率隨著攪拌速度的增大先增大后減小。研究發現，當攪拌速度低于650 r/min時，會產生部分PCL絮狀沉淀，使微球產量減少。當攪拌速度為800 r/min時，分散相能很好地分散于連續相中，成球效果好，載藥率與包封率均較高。

表2不同攪拌速度下的微球載藥率和包封率

Tab 2The drug encapsulation and loading efficiency of microspheres on different stirring rate

樣品攪拌速度(r·min-1)PVA濃度%載藥率%包封率%A45003.510.9±0.350.7±2.0A56503.59.98±0.757.7±0.7A38003.57.81±0.574.9±0.2A610003.54.87±2.147.2±0.1

2.3微球表面形態及粒徑 圖1為分子量為16.5萬的PCL制得的一系列微球(A1～A6)的偏光顯微鏡圖，其粒徑大小見表3，可見微球的粒徑隨PVA濃度和攪拌速度的增大而減小。當PVA濃度為3.5%、乳化攪拌速度為800 r/min時，所制得的微球較其他條件下制得的均一，粒徑大小為50.4 μm。通過掃描電鏡觀察微球表面形貌，可見微球表面光滑，粒徑較為均一，與偏光顯微鏡下的觀察結果一致。圖2為A3與A6微球的掃描電鏡圖。

表3 不同條件下制得的微球的粒徑

2.4XRD結果 載順鉑PCL微球的X射線衍射檢測結果如圖3。順鉑在10°～50°范圍內呈現較多結晶特征衍射峰；空白微球在20°～30°出現了PCL的半結晶性特征峰[8]；載藥微球中保留了順鉑和PCL各自的晶型峰。

2.5不同粒徑微球的體外釋放評價 選擇粒徑分別為50.4 μm(A3)，107.5 μm(A4)及36.5 μm(A6)的3種具有代表性的微球進行藥物體外緩釋實驗。由圖4可知，3種微球突釋現象不明顯，均具有較好的緩釋性能，并且藥物的釋放速度隨粒徑增大而減小。

2.6藥物釋放動力學研究 不同粒徑大小微球的順鉑釋放過程滿足Fickian擴散定律[9]，即藥物的累積釋放率與時間的開方成正比：

微球的PCL分子量均為16.5×104，A1～A6的攪拌速度及所用PVA濃度見表3.

微球的PCL分子量均為16.5×104，PVA濃度均為3.5%，攪拌速度A3，A6分別為800，1 000 r/min.

圖3 順鉑、聚己內酯空白微球及順鉑-聚己內酯微球的XRD圖

n=3.

其中，Mt/M0為藥物累積釋放分數，t為釋放時間，k為釋放常數。對t1/2進行線性擬合，斜率即為k值，擬合度R2越接近于1表示線性越好，越符合Fickian擴散定律[10]。根據體外釋放實驗結果求得的k值見表4，k值越大表示藥物釋放速度越快。

表4順鉑微球體釋放量動力學數據

Tab 4Release kinetic data of cisplatin from microspheresinvitro

樣品k/(%·d-1)R2A310.0380.9542A47.9030.9696A613.4290.9603

3 討 論

順鉑雖是一種廣譜抗癌藥，但因其水溶性差、僅能注射給藥并伴有嚴重的腎及神經毒性等缺點而限制了其應用[11]。順鉑微球制劑研發中，乳化條件在很大程度上影響微球的粒徑、載藥率和包封率，從而影響微球的緩釋性能。本研究探討了載體的分子量、乳化劑濃度、乳化攪拌速度3個影響因素，并研究了PCL對順鉑的緩釋性能。結果發現，用高分子量的PCL制得的微球的載藥率與包封率均比用低分子量的PCL制得的微球大得多，分析原因可能是分子量大的PCL形成的分散相黏度大，利于藥物的粘結與包載。PVA濃度較低時，分子量大的PCL包載藥物乳化成球過程中有少部分PCL未成球而形成絮狀物，使得PVA低濃度下成球的載藥微球具有較高的載藥率，但包封率下降；同樣，乳化攪拌速度偏低時，由于攪拌器對有機相剪切力減弱，乳化效果變差，也易形成部分PCL絮狀沉淀，使微球產量減少。

本研究測定微球的載藥率和包封率所用的標準曲線與體外釋放所用的標準曲線不同，主要原因在于測定載藥率和包封率時需將微球中的順鉑全部萃取出，由于順鉑和PCL都易溶于DMF，且PCL在310 nm處無吸收，故繪制順鉑-DMF標準曲線來測定其載藥率和包封率；而測定體外釋放時，順鉑從微球中釋放量低，順鉑-DMF曲線不能滿足其檢測要求，用DDTC絡合順鉑可提高其紫外吸光值，使檢測更靈敏，故繪制順鉑-DDTC曲線來提高檢測的精確性，保證實驗結果的可靠性。

XRD顯示載藥微球中保留了順鉑和PCL各自的晶型峰，說明順鉑是以結晶態而非無定型態分布在載藥微球中，且載體PCL仍存在結晶區。順鉑在微球中以結晶態存在，使得順鉑的溶出速度較慢，且PCL仍保持有結晶區部分，順鉑無法從載體結晶區擴散，只能通過PCL無定形區擴散釋放，進一步減緩了順鉑的釋放速度[12]，這與體外釋放檢測中無突釋現象相吻合，藥物釋放數據分析表明，順鉑釋放過程以擴散釋放為主，釋放速度與微球粒徑大小有關，粒徑大，釋放速度慢。而微球粒徑大小受制備條件影響，因此研究乳化條件具有重要意義。

該研究中當PVA濃度為3.5%、乳化攪拌速度為800 r/min時，采用高分子量的PCL負載順鉑，可制得粒徑較為均一、大小為54 μm的順鉑微球，載藥率達7.8%、順鉑包封率達75%。有望通過PCL包載順鉑從而提高順鉑的藥效、降低其毒副作用，為今后制備更有效的順鉑微球制劑提供一定的參考價值。