高壓氧聯合神經生長因子局部注射對骨質疏松性骨折延遲愈合患者血清黏附因子及微循環指標表達的影響

白登彥 張文賢

1.甘肅省第二人民醫院骨科，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省中醫院創傷骨科，甘肅 蘭州 730050

骨質疏松癥是由多種原因導致的骨量減少和骨質退變，增加骨脆性，載荷承受力和力學強度下降，從而容易發生細微甚至完全骨折[1]。近年來，由于其極高的發病率、致殘率，骨質疏松癥越加受到醫學界關注。目前部分骨質疏松性骨折患者因治療技術問題以及骨折類型及嚴重程度的影響，出現骨折延遲愈合等嚴重并發癥[2]。部分患者在達到骨折正常愈合所需的時間后，骨折部仍未達到骨折完全愈合的標準[3]。骨折延遲愈合使患者康復時間延長，還有可能出現不愈合或者畸形愈合，增加再次手術風險，嚴重影響患者生活質量。研究[4]表明，神經生長因子能夠促進骨折愈合，且顱腦損傷合并骨折患者，骨折愈合時間顯著比單純骨折患者愈合時間短。OPG/RANKL蛋白系統是由骨保護素 (osteoprotegerin，OPG) 和核因子Kappa B受體活化因子配體 (receptor of activator of nuclear factor B ligand，RANKL) 構成，是機體破骨細胞形成、分化和吸收調節的關鍵系統，對骨質疏松性骨折愈合有重要作用。高壓氧療法是指將患者置于高壓氧倉中，并使患者呼吸高濃度氧氣，以糾正組織缺血缺氧[5]。有研究[6]表明，高壓氧療法具有促進骨折愈合的作用，但是目前關于神經生長因子以及高壓氧療法對骨折延遲愈合患者的影響的報道較少。本研究就高壓氧聯合神經生長因子局部注射對骨質疏松性骨折延遲愈合患者血清黏附因子及微循環指標表達的影響進行報道，旨在指導臨床。

1 材料和方法

1.1 一般資料

研究對象選取我院2016年11月至2017年11月間收治的骨質疏松性骨折且有延遲愈合患者84例，納入標準[7]：①所有患者均符合骨質疏松性骨折診療指南(2017版)中關于骨質疏松性骨折的診斷標準；②康復時間已超過同類骨折的愈合時間但仍未愈合；③同類骨折愈合時間時復查 X 線片仍能夠觀察到骨折線；④骨折端存在少量骨痂且無骨端硬化；⑤均自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：①骨折康復時間不足4月；②骨折處感染嚴重；③病理性骨折；④妊娠期或哺乳期婦女；⑤嚴重系統疾病患者。采用隨機數字法將其分為對照組和觀察組，每組各42例。其中對照組患者年齡50～75歲，平均年齡(56.2±5.9)歲；男22例，女20例；平均病程(10.9±4.9)月。觀察組年齡51～76歲，平均年齡(55.2±5.6)歲；男21例，女21例；平均病程(10.4±5.1)月。兩組患者性別、年齡、平均病程等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。該研究已征得醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

①兩組患者均行復位、固定和功能鍛煉、營養支持等常規治療；②觀察組患者除此之外，進行高壓氧療，使用DG-2600型高壓氧艙進行治療，治療壓力：0 .25 MPa，吸純氧30 min，休息10 min，再開始吸艙內空氣，1次/d，21次/月，持續治療3月；并且在骨折周圍肌肉注射鼠神經生長因子[武漢海特生物制藥股份有限公司，S20060051，20μg(不低于9000AU)/2 mL/瓶]，劑量：20μg/d，持續治療3月。

1.3 觀察指標

觀察指標：①比較兩組患者療效；②比較兩組患者骨密度及紅細胞聚集指數、血漿黏度、紅細胞剛性指數等血液流變學指標；③比較兩組患者sICAM-1、TGF-β1、sVCAM-1、IGF-1、PDGF水平；④比較兩組OPG/RANKL蛋白表達。

1.4 檢測方法及療效標準

檢測方法：抽取患者空腹靜脈血，離心處理后取上清液采用ELISA 試劑盒(上海一基實業有限公司)檢測患者血清sICAM-1、TGF-β1、sVCAM-1、IGF-1、PDGF水平；采用BM830全自動血液分析儀(濟南漢方醫療器械有限公司)檢測患者紅細胞聚集指數、血漿黏度、紅細胞剛性指數等血液流變學指標。骨密度檢測：3個月后，計算尺橈合并的骨密度(BMD)，采用骨密度儀(韓國，型號: EXA-PRESTO) 檢測兩組患者非優勢側前臂橈尺骨遠端的骨密度。

OPG/RANKL蛋白表達檢測：抽取患者空腹靜脈血，采用BCA法測蛋白濃度。行膜轉印和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，單孔上樣量為10μg。轉染后采用濃度為3%的脫脂牛奶封閉NC膜90 min。一抗孵育，過夜且溫度保持為4 ℃，Anti-OPG濃度為1∶2000，Anti-RANKL濃度為1∶3000。TBST清洗后進行二抗孵育，溫度為4 ℃并保持90 min，Goat Anti-Rabbit IgG的濃度為1∶3000。孵育完成后采用化學發光法顯影，β-actin的灰度比與目的基因測量采用灰度分析軟件Image J。所用儀器：水平電泳及其配套裝置由英國CLEAVER公司提供；蛋白印跡轉移裝置由南京科佰生物科技有限公司生產。試劑盒：總蛋白提取試劑盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，BCA蛋白濃度測定試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供，Anti-RANKL及Goat Anti-Rabbit IgG由優寧維公司提供。

療效評定[9]：愈合：①骨折端局部無異常活動，無縱向叩擊痛和壓痛；②外固定拆除后，對于下肢骨折患者，不扶拐時可在平地上連續步行3 min且不少于30 步，對于上肢骨折患者：持重1 kg，可堅持超過1 min；③復查X 線顯示大量骨痂生長，骨折線模糊，連續性骨痂通過骨折線；④連續觀察2 周骨折處不變形。好轉：局部縱向叩擊痛和壓痛減輕，復查X 線顯示中等量或少量骨痂生長，骨折線輕度模糊，但骨折端無硬化現象，功能部分改善。無效：臨床癥狀無減輕，復查X 線示骨折線無改善或不愈合，功能無改善。治療有效率=(治愈+好轉)/總例數×100%

1.5 統計學處理

實驗獲取的數據錄入SPSS 22.0統計學軟件，計量資料表示為均數±標準差，進行t檢驗。計數資料以率(n%)表示，行χ2檢驗，P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者骨折愈合情況比較

觀察組治療后1、2、3個月及6個月骨折愈合率均顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組患者骨折愈合情況的比較[n(%)]Table 1 Comparison of fracture healing between the two groups [n(%)]

2.2 兩組治療前后血液流變學指標比較

治療前，兩組患者的骨量以及紅細胞聚集指數、血漿黏度、紅細胞剛性指數水平比較，差異均無統計學意義 (P>0.05)；治療后，兩組治療結果均優于該組治療前(P<0.05)，其中觀察組明顯低于對照組，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 治療前后兩組患者血液流變學指標的比較Table 2 Comparison of hemorheological indexes between the two groups before and after treatment

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.01。

2.3 兩組治療前后血清黏附因子及BMP-2水平的比較

治療前，兩組患者sICAM-1、BMP-2、sVCAM-1水平差異無統計學意義 (P>0.05)。治療后，兩組治療結果均優于該組治療前(P<0.05)，其中觀察組顯著高于對照組，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 兩組患者化療后血清黏附因子及細胞因子水平的比較Table 3 Comparison of serum adhesion factor and cytokine levels between two groups after chemotherapy

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.01。

2.4 兩組治療前后TGF-β1、IGF-1及PDGF水平的比較

治療前兩組TGF-β1、IGF-1及PDGF水平差異無統計學意義 (P>0.05)，治療后兩組以上細胞因子水平均較治療前有所上升，且觀察組TGF-β1、IGF-1及PDGF水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 兩組治療前后TGF-β1、IGF-1及PDGF水平的比較Table 4 Comparison of TGF- β1, IGF-1, and PDGF levels before and after treatment

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.01。

2.5 兩組OPG/RANKL蛋白表達的比較

治療前兩組OPG/RANKL蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，治療后觀察組OPG/RANKL蛋白表達顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 OPG與RANKL蛋白的SD-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 SD-polyacrylamide gel electrophoresis of OPG and RANKL proteins

圖2 OPG/RANKL 蛋白表達量的柱狀統計圖**P<0.001Fig.2 Columnar statistics of OPG/RANKL protein expression,**P<0.001

3 討論

骨質疏松癥的特征是骨量減少和骨組織結構退化，導致骨脆性增加，骨折危險性升高。骨折愈合是骨折康復過程的一個重要階段，愈合效果也決定著患者術后生活質量[8]。近年研究[9]表明，骨折愈合是機體全身多系統參與的復雜過程，其中微循環指標和生化因子起著重要作用。根據骨折部位和嚴重程度的差異，骨折愈合時間長短不一，一般在4月以內，但骨質疏松癥導致骨折處血運障礙，骨結痂所必須的各種生長因子運輸受阻，最終造成骨折延愈合[10]。骨折延遲愈合會使患者康復時間延長，住院時間增加，不僅增加了患者經濟負擔，還降低了患者生活質量。因此，增加骨量、促進骨吸收、維護骨形成對加速骨質疏松性骨折愈合具有重要意義。

骨重建中，維持骨量需要成骨細胞和破骨細胞共同促進骨吸收和維護骨形成，成骨細胞可分泌骨基質，從而對骨生成具有促進作用。此外，研究[11]還發現，多數骨吸收因子無法直接誘導破骨細胞，其促進骨吸收必須經成骨細胞分泌的RANKL轉導，因此成骨細胞既決定骨生成也具有調控骨吸收的作用。同時OPG也為成骨細胞分泌的骨基質，其可與RANK競爭與RANKL相結合，從而對骨吸收產生抑制作用[12]。動物實驗[13]證實，OPG敲除可有效建立骨質疏松模型，補充外源性OPG可促進骨吸收和增強骨密度及骨強度的作用。OPG蛋白是RANKL(核因子κB受體活化因子配體)的餌受體，是由成骨細胞及骨髓基質細胞分泌產生，其在骨骼系統的生長和愈合中，可抑制破骨細胞的過度產生、分化和成熟，競爭性結合RANKL，從而抑制RANKL與RANK結合，并誘導破骨細胞凋亡。OPG/RANKL蛋白系統的表達，能夠有效的調控破骨細胞的生成，一般來說，當OPG/RANKL的比值上升，破骨細胞的數量和活性將減少，OPG/RANKL的比例下降時，破骨細胞的數量和活性將增加。因此RANK/OPG/RANKL系統可有效調節骨質代謝，與骨質疏松等骨科疾病的發病機制密切相關。血清sVCAM-1和sICAM-1 是細胞外基質和細胞間的黏附因子，是一種微炎性反應因子，其水平的變化能夠反映骨折愈合過程中的炎癥反應；PDGF、IGF-1 是常見的骨生長刺激因子，能夠調節間充質細胞的增殖、分化，促進軟骨細胞增生，對骨折愈合過程中的軟骨內成骨和膜內成骨均有促進作用[14]。TGF-β1是一種細胞因子，生物體發生骨折后，骨折端TGF-β1被激活，并通過促進成骨細胞形成，抑制破骨細胞生成，發揮促進骨折愈合的作用[15]。因此，TGF-β1能夠反映患者骨折愈合情況。

高壓氧療是一種物理治療方法，研究[16]表明，在高壓環境中患者吸入純氧能夠提高血氧張力，氧分子在體內彌散距離增加，深度加大，能夠有效提高血運障礙的延遲愈合骨折端的氧供水平。高壓氧環境能夠促進患者骨折端毛細血管增生，形成有效的側枝循環，恢復骨折處血供。有研究[17]表明，高壓氧治療還能夠減輕骨折處炎癥反應，促進骨痂鈣、磷等電解質沉積，加速骨痂膠原蛋白生成，從而加速血腫機化，促進骨折愈合。神經生長因子是一種多功能因子，骨折后骨折部周圍神經系統被破壞，骨骼肌缺乏神經營養而萎縮，直接阻斷了骨折處血供，導致骨折延遲愈合。通過注射神經生長因子，周圍神經得到再生，間接促進了骨折處血供恢復，促進其愈合。同時，神經生長因子具有增強成骨細胞增生的能力，促進血管內皮細胞因子生成和骨折處新生血管形成，有利于骨折愈合[18]。

本研究中，觀察組患者的治療總有效率為95.42%，顯著高于對照組(76.19%)。治療后，觀察組患者骨量明顯回升，骨密度增加，而且紅細胞聚集指數、血漿黏度、紅細胞剛性指數水平均明顯優于對照組；而且觀察組患者微循環指標發生顯著改善，血漿黏稠度明顯降低，這可能與高壓氧療和神經因子幫助患者骨折端建立了新的血運有關[19]；血漿黏稠度減低后，骨折局部微循環得以改善，氧供恢復，避免了患者發生深靜脈血栓，同時促進了患者骨折愈合。治療后，觀察組患者的sICAM-1、TGF-β1、sVCAM-1水平顯著高于對照組，觀察組患者的IGF-1、PDGF水平顯著低于對照組，這與蔡三等[20]的研究結果一致。通過高壓氧療和局部神經因子注射，患者骨折端血供顯著改善，間充質細胞的快速增殖、分化，同時大量的成骨細胞生成促進了膜內成骨和軟骨內成骨的發生，有助于患者骨痂愈合。總之，OPG/RANKL的比值越大，成骨細胞的介導能力就越強，促進骨生成的作用越大。OPG/RANKL系統的平衡是骨重建和骨量穩定的基礎，也是評估骨重塑過程的指標[21-22]。本研究結果顯示，治療后觀察組OPG/RANKL蛋白表達顯著高于對照組，提示高壓氧聯合神經生長因子局部注射可促進骨生成，進而加速骨折愈合。

綜上所述，高壓氧聯合神經生長因子局部注射能夠顯著改善骨折延遲愈合患者血清黏附因子及微循環指標，提高療效，促進骨折愈合，值得在臨床推廣。