肉桂醛對去卵巢誘導的骨質疏松大鼠模型骨密度和骨量的保護作用

杜秀藩 黃弘軒 熊小龍 曾維鵬 黃暉 王廣積 沈寧江 林堅平

1.海南省人民醫院關節外科，海南 海口 570311 2.廣州醫科大學附屬第一醫院骨科，廣東 廣州 510230

骨質疏松癥是一種常見的慢性骨疾病，其特征在于骨微結構的惡化和骨量的減少。它影響兩性，但是在女性中與男性相比更常見[1-3]。在絕經后期骨質流失更快。骨質疏松癥最重要的后果是發生在椎體、髖部和前臂的骨折。特別是髖部骨折是死亡率和發病率的重要原因。隨著預期壽命的增加，這種并發癥的發生會更為頻繁[4]。骨質疏松癥隱襲發展，其臨床癥狀可能不會出現，直到骨折發生。在后期，臨床上表現為突發性骨折。因此，通過早期診斷和正確治療可以預防骨質疏松癥，這一點非常重要。目前常用于絕經后骨質疏松癥的藥物是雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調節劑、降鈣素、雌激素、重組人甲狀旁腺激素片段等；較高的不良反應如非典型股骨骨折、雙膦酸鹽相關的頜骨壞死、高鈣血癥、血栓栓塞、陰道出血甚至乳腺癌和子宮內膜癌嚴重限制這些藥物的廣泛使用，因此，療效滿意且不良反應小的藥物值得深入研究。大多數植物來源的中藥可能是一種具有廣闊應用前景的藥物。肉桂醛是一種從肉桂皮中提取的醛類成分，已知可用于抑制炎性細胞因子的產生，從而提供抗菌活性。最近，有學者發現用肉桂可抑制核因子-κB配體誘導活化T細胞核因子和激活c-fos表達，并且肉桂醛可以有效抑制破骨細胞樣細胞形成[5]，這些結果可以得到一個假設，肉桂醛(RGQ)具有治療骨質疏松的潛力。本研究的目的是研究肉桂醛對大鼠去卵巢手術誘導的骨質疏松模型中BMD和微結構的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

在該研究中，使用24只健康的成熟雌性Sprague-Dawley大鼠，每只體重220～250 g。動物隨意喂養，并與溫度控制環境22±2 ℃和12 h光照/黑暗周期成對飼養在鋼籠中。實驗程序由我院動物研究委員會批準。所有的動物研究都嚴格按照人類關懷委員會的動物實驗指南進行。

1.2 實驗設計

24只大鼠進行雙側背側卵巢切除術(OVX)，8只大鼠未進行卵巢切除術。對于外科手術，通過腹膜內注射劑量為80和7 mg/kg甲苯噻嗪鹽酸鹽(Alfazyne; Alfasan International BV，Woerden，Holland)和鹽酸氯胺酮的組合麻醉大鼠。所有大鼠在去卵巢手術8周后。將他們分成3組。CON組(n=8)是對照組和未治療。OVX組(n=8)是OVX大鼠和未治療；RGQ組(n=8) OVX大鼠給予肉桂醛75 mg/(kg·d)治療，根據之前的實驗研究選擇肉桂醛的劑量[6]。治療12周后，通過Hologic QDR-4 500 A和“小動物”程序測量全身麻醉下左股骨近端和腰椎兩個區域的大鼠BMD。然后將動物安樂死，采集血樣、取出股骨進行組織病理學檢查。

1.3 骨組織病理學檢查

對于組織學和免疫組織化學研究，所有動物通過腹膜內麻醉。使用氯胺酮(80 mg/kg，Ege Vet，Alfasan International BV，Holland)/甲苯噻嗪(7 mg/kg，Ege Vet，Alfasan International BV，荷蘭)進行過量麻醉處死大鼠。解剖動物的左股骨并在室溫10%甲醛固定劑中保存24 h用于組織形態計量學分析。將標本放入10%甲酸中。脫鈣28 d，然后用光學顯微鏡進行常規檢查。用Leica MR 2145切片機將脫鈣固定的左股骨橫切成厚3 μm切片，用蘇木精-伊紅染色后進行形態測定分析。

1.4 骨小梁形態測量分析

對于每只動物，從石蠟塊的左后肢股骨近端干骺端連續獲得5張橫切片，用于形態測定分析。切片用蘇木精-伊紅染色，并用奧林巴斯顯微鏡拍攝20倍變焦數碼照片。使用半自動數字系統UTHSCSA Image Tools for Windows Version 1.28測量了小梁計數、小梁厚度、小梁面積和小梁分離度。小梁測量在骺板附近0.46 mm處并且于股骨皮層兩側等距離處進行。使用該程序將長度計算為像素(1像素=128×10-8mm)。所有測量均按照Parfit等[7]的文章進行。

1.5 形態測量

對于小梁厚度(μm)和小梁分離度，需對每個小梁至少50個不同點處進行測量，直到平均值變得恒定。通過計數所有骨小梁和每個小梁彼此平行，距離皮層兩側等距離的骨骺板0.46 mm處，獲得小梁計數。小梁面積(mm2)通過確定小梁的邊界在該區域測量小梁的數量來計算。

1.6 血清細胞因子水平的測量

將血液在室溫下以3 000 r/min離心10 min并儲存于-20 ℃備測。使用針對IL-6和TNF-α的市售酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(eBiosciences，Inc，San Diego，CA)測量細胞因子水平。根據制造商提供的指南嚴格進行操作。

1.7 統計學處理

使用非參數(Mann-WhitneyU)檢驗分析所有定量數據。Student的t檢驗被用來評估組間的差異。通過Kruskal-Wallis方差分析評估組間和組內的血清TNF-α和IL-6水平。數據以平均值±標準差表示。P<0.05被認為是差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨密度檢測

各組之間的平均BMD值和組織形態學結果如表1所示。OVX組與CON組比較，股骨和腰椎BMD值顯著降低(P<0.05)。在左側股骨近端和腰椎BMD值方面，RGQ組和OVX組之間差異均有統計學意義 (P<0.05)。

表1 各組平均BMD值 (g/cm2)Table 1 Mean BMD values among the groups (g/cm2)

注：和CON組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.2 組織形態測量結果

OVX組的小梁數量、小梁厚度和小梁面積均顯著低于對照組(P<0.05)。另外，OVX組小梁分離度顯著高于對照組(P<0.05) (表2)。與OVX組相比，RGQ治療顯著增加小梁數量，小梁厚度和小梁面積并減少小梁分離度；差異均有統計學意義(P<0.05)。圖1顯示了各組大鼠股骨骨小梁的組織學切片。

表2 各組之間的組織形態測量結果Table 2 Histomorphometric results among the groups

注：和CON組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

圖1 大鼠股骨骨小梁H&E染色注：A CON組；B OVX組；C RGQ組 (×20)。Fig.1 HE staining of the trabecular of the rat femurs

2.3 血清細胞因子水平

各組的血清細胞因子水平示于表3中。OVX組中的TNF-α和IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05)。與OVX組相比，RGQ治療顯著降低TNF-α和IL-6水平(P<0.05)。

表3 各組之間的平均血漿細胞因子水平Table 3 Mean plasma cytokine levels among the groups

注：和CON組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

3 討論

骨質疏松癥是絕經后婦女中常見的代謝性骨病。由于隨著年齡的增長出現卵巢老化，雌激素合成的減少，表現為骨骼系統中的BMD減少和骨骼中的微結構惡化。絕經后骨質疏松癥是最常見的骨質疏松癥類型。在我們的研究中，RGQ治療對大鼠手術誘導的絕經后骨質疏松癥模型中的小梁骨微構造顯示出相當大的保護作用。同時，股骨和腰椎骨密度均觀察到這種效應。另外，RGQ的抗炎特性可以歸因于保護作用。Bagi等[8]通過骨密度和組織形態計量學分析研究了卵巢切除術對大鼠骨量和骨強度的影響。他們觀察到卵巢切除術可增加骨吸收，從而導致小梁數量、小梁厚度和骨強度的顯著下降。Siu等[9]還在哺乳動物卵巢切除術之前和之后6個月使用高分辨率計算機斷層掃描(CT)以及使用定量CT的BMD研究了骨微結構。在那項研究中，他們確定卵巢切除導致BMD減少以及所有微觀結構參數的變化。至于骨的脆性，研究骨微結構與骨質疏松性骨折之間關系的觀察性研究揭示了骨密度變化對骨結構的決定性作用，獨立于BMD，同時研究指出，骨微結構是骨質量的重要組成部分，并為骨完整性提供重要貢獻[10]。在我們的研究中，與對照組相比，除了卵巢切除術組的骨小梁微結構變化之外， BMD也有顯著減少。

肉桂醛，肉桂樹皮提取物，已知具有抗炎和抗癌的作用[11]。然而，肉桂醛的抗骨質疏松作用尚未在體內廣泛地研究。本研究觀察肉桂醛對去卵巢大鼠骨量和骨強度的影響。從結果來看，肉桂醛治療的效果明顯，肉桂醛能顯著促進骨小梁的形成。此外，定量結果更好顯示骨小梁檢測的參數。隨著肉桂醛的使用，骨密度(BMD)顯著增高，骨強度明顯增加。在細胞水平上，有學者使用來自肉桂皮的乙醇提取物顯著誘導MCF-7細胞的生長，這是一種ER陽性的人乳腺癌細胞系，驗證了肉桂乙醇提取物中植物雌激素的功能。并且他們還發現該提取物增加成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性，膠原合成和骨鈣素分泌[12]。此外，肉桂醛具有抑制破骨細胞功能的效果；有學者發現肉桂醛能抑制破骨細胞樣細胞形成和骨再吸收活性，主要目標被認為是c-fos / NFATc1途徑[5]。NF-κB是一種調節炎癥和免疫基因表達的轉錄因子，在骨質疏松癥進展中也起著至關重要的作用。抑制NF-κB是抑制破骨細胞形成和骨吸收活性的有效方法，有學者指出，肉桂醛對NF-κB轉錄活性具有抑制作用[13]。在本研究中，OVX后破骨細胞的數量明顯增加，并且隨著肉桂醛的處理，其數量逐漸減少，從而抑制骨吸收活性。隨著成骨細胞和骨形成的增加，骨代謝趨于平衡，然后骨質疏松癥得到改善。

一些研究表明炎癥可能導致骨質疏松癥。有研究[14]表明在接受卵巢切除術的健康大鼠中IL-1和TNF-α增加，在卵巢切除術后8周達到最高水平，他們發現這些細胞因子水平的變化與骨吸收指數相關；此外在雌激素缺乏期間細胞因子如IL-6，IL-1，TNF-α和IL-8的產生增加誘導骨吸收；肝勻漿中測得的TNF-α，IL-1和IL-6顯著增加，在去大鼠卵巢后血清IL-6和TNF-α水平顯著升高。RGQ顯示有效的抗炎作用，在細胞和分子水平發揮快速抗炎作用。在本研究中，我們發現與未治療組相比，RGQ治療的去卵巢大鼠血漿IL-6和TNF-α水平顯著降低。為了預防繼發于更年期的骨質疏松癥，已經將多種藥物用于治療，并且新藥的研究仍在進行中。

研究結果顯示，我們不僅檢測到RGQ對BMD的積極的影響，同時也發現它對骨微結構具有顯著的保護作用。另外，RGQ治療的血清IL-6和TNF-α水平顯著下降。總之，RGQ可能是用于治療絕經后骨質疏松癥的候選藥物。但是，需要進行進一步的臨床試驗。