基于響應面法的土茯苓中落新婦苷提取工藝研究

魏玉嬌， 郭曉強， 楊淞瑞， 李小紅， 何源超， 何順東， 劉達玉(.成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 6006；.成都大學 四川抗菌素工業研究所， 四川 成都 6005)

0 引 言

土茯苓為百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，收載于《中國藥典》2015年版中[1].研究表明，土茯苓具有免疫調節、抗炎、抑菌、鎮痛等作用，臨床上用于治療濕熱淋濁、筋骨疼痛、頭痛等癥[2].落新婦苷是土茯苓中關鍵的活性成分和質量控制指標成分，為二氫黃酮醇苷類化合物，《藥典》中規定土茯苓按干燥品計算，落新婦苷含量不得少于0.45%[1，3].目前，對土茯苓中落新婦苷的提取方法有回流提取、微波提取和超聲提取等，其中，超聲提取相較于回流提取法耗時較少，相較于微波提取法更適合工業生產[4-5].本研究以土茯苓為原料，采用超聲法提取其中的落新婦苷，利用HPLC法測定提取液中落新婦苷的含量，并通過響應面法來優化從土茯苓中提取落新婦苷的工藝，擬為土茯苓的實際應用提供參考依據.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：土茯苓中藥飲片(批號，18080279)，購自四川千方中藥股份有限公司；落新婦苷對照品(批號，14070401，純度≥99%)，購自成都普瑞法科技開發有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

2 方 法

2.1 落新婦苷含量測定

2.1.1 樣品粉末的制備.

取一定的土茯苓飲片，稱重，干燥2 h后稱重.再粉碎，過4號篩(60目)，制得樣品粉末.

2.1.2 供試品溶液的制備.

精密稱取過篩后的樣品粉末10 g于具塞錐形瓶中，按照一定的料液比、乙醇濃度、提取時間進行超聲提取，然后過濾，合并濾液，濃縮，用無水乙醇定容至250 mL，制得供試品溶液，備用.

2.1.3 對照品溶液的制備.

精密稱取干燥至恒重的落新婦苷對照品0.0010 g、0.0030 g、0.0050 g、0.0070 g、0.0090 g于10 mL容量瓶中，用流動相(甲醇—0.1%冰醋酸=35∶65)溶解并定容到10 mL，制成濃度分別為0.10 mg/mL、0.30 mg/mL、0.50 mg/mL、0.70 mg/mL、0.90 mg/mL的系列對照品溶液.

2.1.4 色譜條件.

實驗的色譜條件為：色譜柱為SinoChrom ODS-BP 5 μm(4.6 mm×150 mm)，流動相為甲醇—0.1%冰醋酸(35∶65，v/v)，流速1.0 mL/min，檢測波長291 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL.

分別取對照品溶液和供試品溶液進行分析，落新婦苷和其他雜質均可完全分離，峰形符合要求，結果如圖1和圖2所示.

圖1 落新婦苷對照品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖

2.1.5 線性關系.

分別精密吸取落新婦苷對照品溶液適量，用流動相稀釋成質量濃度分別為0.0167 mg/mL、0.0500 mg/mL、0.0833 mg/mL、0.1167 mg/mL、0.1500 mg/mL的系列對照品溶液.吸取各對照品溶液10 μL，按“2.1.4"項下的色譜條件進行分析.以質量濃度C(mg/mL)為橫坐標、峰面積積分值A為縱坐標，繪制標準曲線，得落新婦苷的回歸方程為，A=2×107C+102 934(R2=0.999).結果表明，落新婦苷在0.0167～0.1500 mg/mL范圍內線性關系良好.

2.1.6 精密度.

分別精密吸取落新婦苷對照品溶液10 μL，連續進樣6次，得到落新婦苷的峰面積積分值，計算其RSD值為0.06%(n=6).結果表明，儀器精密度良好.

2.1.7 穩定性.

精密吸取同一個供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10 h內各進樣10 μL，測定落新婦苷的峰面積積分值，計算其RSD為0.04%(n=6).結果表明，供試品溶液在10 h內基本穩定.

2.1.8 重復性實驗.

取同一批次的樣品粉末共6份，分別按“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液，測定落新婦苷的含量，計算其RSD為0.11%(n=6).結果表明，測定方法重復性良好.

2.1.9 回收率.

精密量取已知落新婦苷濃度的樣品溶液2 mL，共5份，每份分別精密加入落新婦苷對照品溶液各100 μL(共0.2 mg)，用流動相定容制備成供試品溶液，按“2.1.4”項下的色譜條件進行測定，計算落新婦苷的平均回收率為99.27%，RSD為1.10%，結果見表1.

表1 供試品中落新婦苷的平均回收率

2.2 單因素實驗.

2.2.1 乙醇濃度對落新婦苷含量的影響.

固定料液比為1∶20(g∶mL)，超聲波法提取落新婦苷，提取時間30 min，考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%、95%)對土茯苓提取物中落新婦苷含量的影響，共做3組平行實驗，取平均值.

2.2.2 提取時間對落新婦苷含量的影響.

固定料液比為1∶20(g∶mL)，乙醇濃度為80%，超聲波法提取落新婦苷，考察提取時間(15、30、60、90、120 min)對土茯苓提取物中落新婦苷含量的影響，共做3組平行實驗，取平均值.

2.2.3 料液比對落新婦苷含量的影響.

固定乙醇濃度為80%，提取時間為90 min，超聲波法提取落新婦苷，考察料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g∶mL))對土茯苓提取物中落新婦苷含量的影響，共做3組平行實驗，取平均值[4].

2.3 響應面實驗設計

根據單因素實驗結果，選取乙醇濃度(X1)，提取時間(X2)和料液比(X3)3個因素作為自變量，以土茯苓提取液中落新婦苷含量為因變量，進行響應面分析，優化土茯苓中落新婦苷的提取工藝，因素水平見表2.

表2 土茯苓中落新婦苷提取工藝的因素水平

3 結果與分析

3.1 單因素實驗

3.1.1 乙醇濃度對提取液中落新婦苷含量的影響.

乙醇濃度對提取液中落新婦苷含量的影響如圖3所示.

圖3 乙醇濃度對提取液中落新婦苷含量的影響

由圖3可知，固定料液比和提取時間，隨著乙醇濃度的不斷增大土茯苓提取液中落新婦苷含量呈現先增加后降低之趨勢，乙醇濃度為80%時達到最大，當乙醇濃度大于80%時，落新婦苷含量下降明顯.故，初步確定提取溶劑乙醇濃度為80%.

3.1.2 料液比對提取液中落新婦苷含量的影響.

料液比對提取液中落新婦苷含量的影響如圖4所示.

圖4 料液比對提取液中落新婦苷含量的影響

由圖4可知，固定乙醇濃度和提取時間，樣品粉末與提取液的比例為1∶10(g∶mL)時，落新婦苷的含量最高.故，初步確定提取料液比為1∶10(g∶mL).

3.1.3 提取時間對提取液中落新婦苷含量的影響.

提取時間對提取液中落新婦苷含量的影響如圖5所示.

圖5 提取時間對提取液中落新婦苷含量的影響

由圖5可知，固定乙醇濃度和料液比，隨著提取時間的不斷增大，落新婦苷含量也增大，當提取時間為90 min時，落新婦苷含量最高.故，初步確定提取時間為90 min.

3.2 響應面法分析

3.2.1 回歸模型的建立和方差分析.

根據BOX-Behnken實驗設計原理和單因素實驗結果，以乙醇濃度、料液比、提取時間為研究因素，提取液中落新婦苷含量為響應值.采用三因素三水平響應面分析方法，進行響應面分析實驗，結果見表3，方差分析見表4.

表3 土茯苓中落新婦苷提取工藝響應面方案設計及實驗結果

以提取液中落新婦苷含量為響應值的線性回歸方程為，

Y=0.046+1.750E-003A+6.500E-003B-4.500E-003C+2.500E-004AB+5.750E-003AC-3.750E-003BC-0.016A2-0.016B2-9.125E-003C2(R2=0.951).

表4 土茯苓中落新婦苷提取工藝回歸分析結果

由表4可知，回歸模型達到顯著水平，失擬項不顯著(P>0.05)，說明方程對實驗的擬合程度較高，使用該方程模擬真實的三因素三水平分析是可行的，即本實驗所得二次回歸方程與實際情況吻合度較好.A、C、AB、AC、C2對結果的影響表現為顯著(P<0.05)，各因素對土茯苓中落新婦苷提取工藝的影響大小依次為提取時間、乙醇濃度、料液比.

3.2.2 響應曲面分析.

為了進一步研究變量之間的相互作用，應用Design Expert 8.0.6軟件模擬了各個因素對落新婦苷含量影響的3D響應曲面圖和等高線圖，結果見圖6～圖8.

由6圖可知，響應面曲線變化相對陡峭，等高線呈橢圓形，表明乙醇濃度和料液比的交互作用明顯，對土茯苓提取液中落新婦苷含量的影響也較為顯著.當乙醇濃度與提取時間適當增加時，落新婦苷的含量也隨之增大，且有穩定的最大值.

由圖7可知，乙醇濃度和提取時間的交互作用對土茯苓提取液中落新婦苷含量的影響明顯，等高線稀疏且呈橢圓形，而且弧度較大，說明兩因素的交互作用比較明顯.

由圖8可知，響應曲面變化較平緩，等高線近似圓形，說明料液比和提取時間的交互作用不明顯，且對土茯苓提取液中落新婦苷含量的影響相對不顯著，隨著提取時間和乙醇濃度的同時增大，落新婦苷的含量呈先增大后降低的拋物線趨勢[6-8].

同時，本研究利用Design Expert 8.0.6軟件對回歸模型進一步分析，得到土茯苓中落新婦苷提取工藝的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為67.7%，提取時間為87.5 min，料液比為1∶10.3(g∶mL)，在上述提取工藝條件下土茯苓提取液中落新婦苷的含量理論值為0.0621 mg/mL.

圖6 乙醇濃度和料液比交互作用對土茯苓提取液中落新婦苷影響的響應面圖

圖7 乙醇濃度和提取時間交互作用對土茯苓提取液中落新婦苷影響的響應面圖

圖8 提取時間和料液比交互作用對土茯苓提取液中落新婦苷影響的響應面圖

3.2.3 驗證實驗.

為了驗證響應面法優化結果的可靠性，同時考慮到實際情況和操作方便，修正后的優化條件為：提取時間為90 min，乙醇濃度為70%，料液比為1∶10(g∶mL).進行3次平行實驗，取平均值，并將預測值與實測值進行統計，結果見表5.

表5 驗證實驗結果

由表5可知，預測值與實測值之間的平均偏差為2.0%(<5%)，說明本實驗所建立的數學模型具有良好的預測性，該提取工藝準確可行.

4 結 論

本研究通過響應面法優化土茯苓中落新婦苷提取工藝為：提取時間為87.5 min，乙醇濃度為67.7%，料液比為1∶10.3(g∶mL)，土茯苓提取液中落新婦苷含量的預測值為0.0621 mg/mL.驗證實驗結果顯示，預測值與實測值之間的平均偏差為2.0%，說明本實驗所建立的數學模型具有良好的預測性，該提取工藝準確可行.根據優化結果和實驗操作條件，最終確定土茯苓中落新婦苷的提取工藝為：提取時間為90 min，乙醇濃度為70%，料液比為1∶10(g∶mL)，實驗測定土茯苓提取液中落新婦苷平均含量為0.0611 mg/mL.本研究結論可為土茯苓的實際應用與開發提供參考依據.