微生物發(fā)酵劑對四川風(fēng)羊腿產(chǎn)品特性的影響

王 衛(wèi)， 何 丹， 張佳敏， 趙志平， 白 婷， 吉莉莉， 陳 林(成都大學(xué) 肉類加工四川省重點實驗室， 四川 成都 610106)

0 引 言

風(fēng)羊腿是我國傳統(tǒng)特色腌臘肉制品，產(chǎn)品以羊后腿為原料，經(jīng)修整、上鹽、腌制、自然風(fēng)干、貯藏成熟等工序制作而成，加工及貯藏期因不同地區(qū)在數(shù)周至數(shù)月[1].研究表明，風(fēng)羊腿屬于aw值為0.70～0.80的典型半干水分食品(IMF)，具有極佳的非制冷可貯藏性[2].其特有風(fēng)味的形成，主要取決于風(fēng)干進(jìn)程中以理化為主導(dǎo)，微生物參與的脂肪和蛋白質(zhì)分解、氧化等反應(yīng)，逐漸產(chǎn)生醛、酮、酸等一系列小分子化合物[3].借鑒西式微生物發(fā)酵劑干預(yù)技術(shù)，通過添加微生物發(fā)酵劑提升風(fēng)味和品質(zhì)，縮短發(fā)酵期，實現(xiàn)過程安全可控等，已成為傳統(tǒng)腌臘制品目前研究的熱點[4-5].

前期研究結(jié)果證實，添加微生物發(fā)酵劑的產(chǎn)品，其含水量、aw和pH值變化幅度顯然更大，發(fā)酵進(jìn)程更快，發(fā)酵微生物呈現(xiàn)出極為顯著的抑制脂肪氧化和降低硝鹽殘留作用[6-8].以此為基礎(chǔ)，本研究重點對四川風(fēng)羊腿中的總氮(TN)、非蛋白氮(NPN)、游離氨基酸和風(fēng)味物含量進(jìn)行測定分析，以進(jìn)一步探究發(fā)酵劑對產(chǎn)品風(fēng)味等特性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料.

實驗所用材料包括：羊腿，由四川北牧南江黃羊集團(tuán)有限公司提供；直投式凍干菌，由德國Chr. Hansen公司提供，菌種組合為肉色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和漢遜德巴利酵母菌.

1.1.2 儀 器.

實驗所用儀器包括：TJA-3130N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；ZFD-A5140型鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；HP-6890/5973型氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司)；LRH-250型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司).

1.2 風(fēng)羊腿制作

1.2.1 產(chǎn)品配方及實驗組設(shè)置.

以羊后腿為原料，每1 000 g肉料添加食鹽70 g、亞硝酸鈉0.1 g、D-異抗壞血酸鈉0.8 g、葡萄糖5.0 g、八角2 g、花椒4 g.設(shè)置不添加發(fā)酵菌的傳統(tǒng)自然風(fēng)干A組和添加直投式凍干菌的B組.

1.2.2 制作工藝及主要技術(shù)參數(shù).

風(fēng)羊腿的制作工藝及主要技術(shù)參數(shù)為：修整→上鹽→入缸腌制(4 ℃，10 d，其間上下翻動3～4次)→清洗晾掛→修割整形→發(fā)酵風(fēng)干(8～12 ℃，相對濕度50%～65%，26 d，至失重30%～32%)→切段、真空包裝→貯藏(6～8 ℃，15 d)→成品.

1.3 產(chǎn)品指標(biāo)檢測

1.3.1 檢測指標(biāo)及方法.

分別對風(fēng)羊腿的原料(RM)，腌制后(AP)，發(fā)酵風(fēng)干的第2～26 d(FD2至FD26)，以及包裝貯藏后成品(PS)按照如下方法進(jìn)行指標(biāo)測定：

1)TN含量參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.5-2016進(jìn)行測定.

2)NPN含量測定.樣品自然解凍后，剔除可見脂肪和筋膜，絞碎，稱取4 g，加入0.05 mol/L的檸檬酸緩沖溶液(pH值為6.0)20mL，在冰浴中用組織搗碎機(jī)搗碎3次(22 000 r/min，每次10 s，間隔10 s)，于4 ℃下放置2 h后，于4 ℃下10 000 r/min離心15 min，快速濾紙過濾，在濾液中加入10%三氯乙酸(TCA)20 mL混合均勻，于4 ℃下放置過夜，然后2 500 r/min離心10 min，過濾后收集濾液，按半微量凱氏定氮法測定樣品NPN含量.

3)游離氨基酸含量測定.將樣品與去離子水按1∶2混合，勻漿后50 ℃水浴40 min，然后在4 ℃下8 000 r/min離心30 min.取750 μL上清液，加入300 μL(2 moL/L)KHCO3，用異硫氰酸苯酯(PITC)衍生1 h，取出后加入600 μL 1 moL/L HCl終止反應(yīng)，冷卻，高速離心12 000 r/min，10 min.取上清液進(jìn)樣測定.

在色譜分析時，色譜柱為Agilent C18柱，洗脫速度0.8 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，檢測波長254 nm，柱溫(40±1)℃；流動相A為600 mL乙腈和400 mL超純水混合，經(jīng)用0.22 μm水系濾膜過濾，脫氣備用；流動相B為11.48 g乙酸鈉，0.5 mL三乙胺(TEA)溶解于1 L超純水中，用1%醋酸調(diào)節(jié)pH值為6.4，混合均勻后，用0.22 μm水系濾膜過濾.同時，將復(fù)合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.01mol/L HCl稀釋成不同濃度梯度.

4)揮發(fā)性風(fēng)味成分測定.揮發(fā)性風(fēng)味成分參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行測定，并稍作修改，具體步驟為：在風(fēng)羊腿中段深入表皮1 cm下取樣，將肉樣剪碎后，準(zhǔn)確稱取3.0 g粉碎均勻的樣品，放入15 mL頂空瓶中密封，采用動態(tài)頂空制樣.GC-MS分析圖譜經(jīng)計算機(jī)和人工把每個峰同時與NIST library和Wiley Library相匹配檢索定性，匹配度和純度大于800(最大值1 000)作為定性分析結(jié)果.對化合物進(jìn)行定量分析時，對總離子流量色譜圖用峰面積歸一化法定量，得出各組分的相對含量.

固相微萃取條件的為：固相微萃取頭CAR/PDMS 75 μm(美國SUPELCO 公司)，萃取溫度80 ℃，萃取時間40 min，解吸時間3 min.

儀器條件為：色譜柱為HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比2∶1.升溫程序為起始溫度50 ℃，保持3 min，以每分鐘5 ℃速率升至150 ℃，再以每分鐘10 ℃速率升至260 ℃.離子源EI，電離能量70 EV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍20～450 amu.

1.3.2 統(tǒng)計分析.

用Origin 7.5作圖，并用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析.

2 實驗結(jié)果及分析

2.1 加工進(jìn)程中TN和NPN變化

風(fēng)羊腿加工進(jìn)程中TN和NPN變化見圖1和圖2.

圖1 加工進(jìn)程中TN含量變化曲線

圖2 加工進(jìn)程中NPN含量變化曲線

由圖1和圖2可知，羊腿肉TN初始含量為9.24%，腌制期結(jié)束時稍降低，在風(fēng)干發(fā)酵進(jìn)行中逐漸有所上升，風(fēng)干發(fā)酵結(jié)束時未添加微生物發(fā)酵劑的A組TN值和NPN值分別為11.06%和0.24%，真空包裝貯藏15 d后為11.57%和0.26%.風(fēng)干發(fā)酵結(jié)束時添加微生物發(fā)酵劑的B組TN值和NPN值分別為11.06%和0.26%，真空包裝貯藏15 d后為11.57%和0.24%.TN值在包裝貯藏期有較顯著提升，NPN值變化不大，視乎呈現(xiàn)后發(fā)酵現(xiàn)象.兩組比較，添加發(fā)酵劑組變化幅度稍大，但兩組差異不顯著.

2.2 加工進(jìn)程中游離氨基酸變化

風(fēng)羊腿加工進(jìn)程中游離氨基酸變化見表1和表2，總游離氨基酸變化見圖3.表1、2中，RM為原料，AP為腌制后制品，F(xiàn)D為發(fā)酵風(fēng)干時間(天)，PS為包裝貯藏后成品.

圖3 加工進(jìn)程中總游離氨基酸變化曲線

結(jié)果顯示，游離氨基酸量均隨羊肉火腿加工進(jìn)程有不同程度的增加.未添加微生物發(fā)酵劑的A組，原料肉中游離氨基酸總量為635.69 mg /100 g，產(chǎn)品中游離氨基酸總量為3 115.08 mg /100 g，增加了4.9倍.添加微生物發(fā)酵劑的B組原料肉中游離氨基酸總量為636.82 mg/100 g，產(chǎn)品中游離氨基酸總量為5 211.18 mg/100 g，增加了8.2倍.添加微生物發(fā)酵劑呈現(xiàn)極為顯著的加速蛋白質(zhì)分解，促進(jìn)游離氨基酸的形成.

未添加微生物發(fā)酵劑的A組，游離氨基酸增加最多的是苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)，其次是精氨酸(Arg)、纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)等，胱氨酸(Cys)則降低較多.添加微生物發(fā)酵劑的B組，游離氨基酸增加最多的是谷氨酸(Glu)、組氨酸(His)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)，其次是異亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和丙氨酸(Ala)等，胱氨酸(Cys)稍有下降.

表1 風(fēng)羊腿(A組)游離氨基酸測定結(jié)果表/(mg/100 g)

表2 風(fēng)羊腿(B組)游離氨基酸測定結(jié)果表/(mg/100 g)

2.3 產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

本研究采用GC-MS分析法對兩組羊腿產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4和表3.

圖4 風(fēng)羊腿揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流圖

由圖4和表3可知，就風(fēng)味物相對含量上比較，A組含量最高的為醇類和酸類，其次分別為醛類、酮類、烯烴類和酚類，酯類物質(zhì)未檢出；B組含量最高的為醇類和醛類.而從生成的風(fēng)味物種類分析，A組依次為：酸類(8種)>醇類(5種)>醛類(4種)>烯烴類(3種)=酚類(3種)>酮類(2種)>酯類(0種)；B組中依次為：醛類(13種)>醇類(8種)=酸類(8種)>酯類(5種)>酮類(3種)>烯烴類(2種)=酚類(2種).A組共檢出25種，B組共檢出41種，添加微生物發(fā)酵劑的B組顯然更多，表明微生物發(fā)酵劑對風(fēng)羊腿風(fēng)味物質(zhì)形成發(fā)揮了促進(jìn)作用，這與Wang等[7-8]在微生物發(fā)酵劑對四川臘腸和臘肉風(fēng)味影響的研究中的結(jié)果相符.

對產(chǎn)品中各類風(fēng)味成分進(jìn)行分類分析比較發(fā)現(xiàn)，醇類物質(zhì)在未添加微生物發(fā)酵劑的A組中檢測到5種，在添加微生物發(fā)酵劑的B組中檢測到8種，兩組中均檢測到的物質(zhì)為乙醇、正戊醇、沉香醇、α-松油醇和苯甲醇，添加了微生物發(fā)酵劑的B組產(chǎn)品α-松油醇和苯甲醇含量較A組有所提升，此外，1-己醇、2-辛烯-1-醇和正辛醇也比A組更加豐富；醛是肉香味的主要成分，未添加微生物發(fā)酵劑的A組產(chǎn)品中檢測出了4種醛類化合物，其中主要為壬醛，添加微生物發(fā)醇劑的B組產(chǎn)品中檢測出了13種醛類化合物，與未添加微生物發(fā)酵劑的A組相比，醛類化合物的種類和含量均得到提升， 說明微生物對提升醛類化合物含量具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用；酸類物質(zhì)在兩組產(chǎn)品中均檢測出8種，主要為乙酸，但添加微生物發(fā)酵劑的B組乙酸含量與未添加微生物發(fā)酵劑的A組相比大大降低；酯類物質(zhì)在未添加微生物發(fā)酵劑的A組中未檢出，在添加微生物發(fā)酵劑的B組中檢出5種，以辛酸乙酯和癸酸乙酯為主，具有果香和酒香香氣，對風(fēng)味有促進(jìn)作用.對比可見，添加了微生物發(fā)酵劑的B組產(chǎn)品酸類物質(zhì)有所降低，而酯類物質(zhì)含量得到提升，烯烴類化合物及酚類化合物兩組產(chǎn)品之間差異不大.

表3 風(fēng)羊腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較

3 結(jié) 論

本研究在四川風(fēng)羊腿加工中，以傳統(tǒng)工藝為基礎(chǔ)，選擇商業(yè)化直投式微生物發(fā)酵劑，進(jìn)行了腌制、風(fēng)干發(fā)酵、包裝貯藏等制作工序，并對不同階段產(chǎn)品TN、NPN、游離氨基酸和風(fēng)味物含量進(jìn)行了分析.結(jié)果顯示：加工進(jìn)程中TN和NPN在包裝貯藏期有較顯著提升，但添加與未添加發(fā)酵劑的產(chǎn)品差別不顯著.游離氨基酸量均隨羊肉火腿加工進(jìn)程有不同程度的增加，未添加微生物發(fā)酵劑的產(chǎn)品增加了4.9倍，添加微生物發(fā)酵劑產(chǎn)品增加了8.2倍，添加微生物發(fā)酵劑呈現(xiàn)極為顯著的加速蛋白質(zhì)分解，促進(jìn)游離氨基酸的形成；風(fēng)味物種類和含量檢測結(jié)果中，添加微生物發(fā)酵劑的產(chǎn)品，風(fēng)羊腿的風(fēng)味物種類達(dá)到41種，而未添加微生物發(fā)酵劑的產(chǎn)品僅為25種，尤其是在醇類、醛類及酯類物質(zhì)的種類和含量上，添加微生物發(fā)酵劑的產(chǎn)品均更為豐富，其中，醇類物質(zhì)增加了3種，醛類物質(zhì)增加了9種，酯類物質(zhì)檢測出5種，而未添加發(fā)酵劑的產(chǎn)品未檢出酯類物質(zhì).出現(xiàn)上述結(jié)果的影響成因和機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究.