SNP-array分析在超聲波檢測頸項透明層增厚胎兒的遺傳學診斷中的應用 *

歐陽魯平，劉文慧，覃秀云，王 錦，孫惟佳

(1.廣西壯族自治區婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，南寧 530001；2.桂林醫學院第二附屬醫院檢驗科，廣西桂林 541100；3.南寧市第四人民醫院超聲影像科，南寧 530023)

頸項透明層(nuchal translucency，NT)指妊娠11～13+6周胎兒頸后皮下液體積聚的厚度，在超聲影像上是胎兒頸后皮下的無回聲帶，為妊娠早期篩查胎兒染色體非整倍體異常的重要指標，被廣泛應用于臨床。研究報道，NT增厚不僅與胎兒染色體異常有關，還與胎兒嚴重心臟畸形、某些胎兒遺傳疾病等密切相關[1]。單核苷酸多態芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)技術是新興的分子核型檢測技術，具有眾多優勢：如高分辨率、高通量、高敏感性和高準確性等，優于傳統的G顯帶檢測方法。本文對130例NT≥3.0 mm的胎兒進行產前診斷，在染色體核型分析基礎上加上SNP-array芯片技術檢測，并隨訪其妊娠結局，探討SNP-array芯片技術檢測對胎兒NT增厚胎兒產前診斷的臨床意義，為臨床決策、預后評估和遺傳咨詢提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 取自2017年1月～2018年6月，在廣西壯族自治區婦幼保健院醫學遺傳門診就診的孕婦，行早孕期超聲篩查的130例11～13+6周NT增厚(NT≥3.0 mm)胎兒，行介入性產前診斷，絨毛取樣活檢術。行染色體核型及SNP-array檢測，孕婦簽署知情同意書后，隨訪記錄妊娠結局。

1.2 儀器與方法

1.2.1 儀器：應用GE Voluson E8，Philips iu22，Siemens ACUSON Sequoia 512及S200彩色多普勒超聲診斷儀，經腹部超聲檢查探頭頻率2.0～6.0 MHz，經陰道超聲檢查探頭頻率5.0～8.0 MHz；超凈工作臺，CO2細胞培養箱，定時烘箱，醫用低速離心機，高速離心機(Labnet，美國)，PCR擴增儀(ABI，美國)，iScan(illumina，美國)，高速冷凍離心機(Thermo，美國)，Lab-Aid 820核酸提取儀(廈門至善，中國)等。

1.2.2 超聲篩查NT測量方法：檢查前向孕婦告知孕11～13+6周胎兒超聲篩查的重要性與局限性，并簽署知情同意書。NT測量在正中矢狀切面上進行，胎體自然屈曲，盡可能放大圖像，僅顯示胎頭和上胸部，使游標尺的輕微移動只改變測量結果的0.1 mm。測量時注意辨別胎兒皮膚及羊膜。測量頸后皮下無回聲帶的最大厚度，至少測量3次，取最大值。

1.2.3 介入性產前診斷：130例孕婦于孕早期11～13周經腹行胎兒絨毛活檢術，抽取絨毛組織25 mg。

1.2.4 絨毛DNA提取：采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)試劑盒來提取基因組DNA，并運用SNP-array檢測；NanoDrop2000(Thermo Fisher scientific INC，美國)測定DNA濃度，需要保證DNA濃度大于50 ng/L，A260nm/A280nm處在1.8～2.0范圍。

1.2.5 絨毛染色體核型分析步驟：倒置解剖鏡按照本實驗室制定絨毛分離法[2]，分離出干凈的絨毛標本，常規培養，觀察，收獲標本，適宜環境下滴片，80℃烤6h，采用G顯帶，顯微鏡下計數與分析。顯微鏡下計數20個核型，分析5個核型，遇到嵌合體加倍計數。

1.2.7 SNP-array檢測：應用美國Affymetrix CytoScan 750K芯片平臺對這些樣本進行基因拷貝數變異(CNVs)分析。實驗操作嚴格按照Affymetrix公司提供的操作流程。用Affymetrix 7G掃描儀掃描芯片，掃描信號圖經過Affymetrix的Chas軟件分析和計算。

1.2.8 SNP-array檢測的判斷和評價：數據分析參照本實驗室內部數據庫以及DGV，DECIPHER，UCSC，OMIM等公共官網數據庫。

1.3 統計學分析 根據NT值統計所有入選病例的染色體核型與SNP-array檢測結果，隨訪胎兒異常情況及妊娠結局。應用SSPS19.0軟件進行分析，資料分析采用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 染色體核型分析 130例胎兒NT增厚病例行絨毛膜取樣活檢。95例染色體核型正常，35例染色體核型異常(26.9%)，其中13-三體5例；18-三體8例；21-三體10例；45，X：3例，47，XXX：1例；47，XYY：1例；嵌合體3例；46，XY，inv(9)(p12q13)：2例；46，XY，der(11)t(4；11)(q28.1；q24.3)：1例；46，XY，der(14；21)(q10；q10)，+21：1例。

2.2 SNP-array檢測結果 130例胎兒NT增厚病例行絨毛膜取樣活檢，提取DNA行SNP-array檢測。86例基因芯片拷貝數正常，44例基因芯片拷貝數異常(33.8%)。

2.3 基因芯片與核型分析對絨毛標本檢出異常情況 核型分析檢出遺傳異常35例，基因芯片檢出異常44例，兩種技術檢出率差異有統計學意義(χ2=6.23P<0.05)；同時染色體核型分析結果與基因芯片結果不一致以及隨訪結果。11例超聲波指征為：NT增厚，結果見表1。

表1 11例SNP部分微缺失、微重復的陽性結果

3 討論

NT測量是早孕期最簡單有效的提示胎兒染色體異常的篩查方法之一。2004年，英國胎兒基金會建議早孕期產前篩查內容包括孕婦年齡、NT三項、血清學篩查，可使21-三體綜合征的篩查率高達80%～90%之間。最近幾年國內對于NT檢查在染色體非整倍體的篩查作用也給予了肯定[3]。此外，NT異常與心臟畸形、不良妊娠結局、發育遲緩等也有相關性[4]。對于NT增厚的具體生理機制目前尚無明確的理論解釋，主要有以下觀點[5]：與胎兒染色體的異常、貧血及低蛋白血癥、淋巴系統異常和回流受阻、頸部淋巴回流障礙，過多的淋巴液積聚于頸后胎兒心臟畸形繼發心力衰竭有關。國外學者研究發現 NT增厚的胎兒中14.2%并發染色體異常[6]。NT增厚染色體正常的胎兒，其不良妊娠結局的發生率隨著NT測量值的增高而增高，主要表現為先天性心臟病[7-9]。

傳統的染色體核型分析需要經過細胞培養、制片、染色等復雜手段，且其分辨率一般為5M～10M。但小于5M的小片段的拷貝數變異(copy number variations，CNV)，常規核型分析技術難以發現。并且染色體培養的過程較困難，存在一定的細胞培養失敗概率，為后期的分析和發報告造成困難。基因芯片檢測是近年發展起來的分子生物學檢測方法，其特點是分辨率高、檢測速度快、檢測通量高，可分辨出100K以內的染色體片段變異。由于該基因芯片檢測不需要進行細胞培養，因此其適用于細胞培養較難成功的檢測樣本，或者有明顯癥狀但常規核型分析未檢出異常的樣本。染色體微陣列分析技術包括基于微陣列的比較基因組雜交(array based Comparative Genomic Hibridization，aCGH)技術和單核苷酸多態性微陣列技術，能夠在全基因組水平進行檢測染色體不平衡的拷貝數變異，且較染色體核型分析具有更高的分辨率和敏感度，目前廣泛應用于胎兒異常的產前診斷。單核苷酸多態芯片(array single nucleotide polymorphism，array-SNP)技術是一項新興的分子分析技術，能夠在全基因組水平進行掃描，檢出100kb以下的基因拷貝數變異，除了能檢出非整倍體異常，還能檢測核型分析無法發現的低水平拷貝數變異、染色體雜合性缺失等拷貝數正常的染色體異常，進一步檢測出染色體微缺失或微重復所涉及的基因、發生的位置以及片段大小，優于傳統的G顯帶檢測方法。但目前基因芯片無法分析染色體的結構變異[10]，本文中染色體核型除了檢出13-三體5例，18-三體8例，21-三體10例，45，X：3例，47，XXX：1例，47，XYY：1例，嵌合體3例，還檢出2例46，XN，inv(9)(p12q13)，這是芯片檢測技術不能檢出的，因此在產前診斷時基因芯片檢測與常規染色體分析同時實施檢測。SNP-array檢測技術能提高致病性CNVs的檢出率，建議NT增厚胎兒應同時行傳統染色體核型和SNP-array檢測分析。

本研究通過檢測130例胎兒NT增厚的胎兒樣本，染色體核型異常檢出35例，檢出率26.9%(35/130)，SNP-array檢出44例異常，檢出率33.8%(44/130)，SNP-array異常檢出率明顯高于染色體核型異常檢出率，并且差異具有統計學意義(P<0.05)。對彩色多譜勒胎兒NT增厚的胎兒樣本，SNP-array檢測有助于發現染色體核型分析無法檢出的染色體亞顯微結構異常，SNP-array有利于提高對NT增厚胎兒遺傳病因的診斷。應用SNP-array檢測胎兒NT增厚樣本進行檢測，異常檢出率提高了6.9%，稍微低于楊鑫等[11]人報道的7.69%，但SNP-array技術可明顯提高疾病的診斷率。SNP-array檢測不經細胞培養，少量胎兒組織的基因組DNA就達到檢測目的，有助于排除致病性染色體微缺失/微重復綜合征，避免患兒出生，得以減少出生缺陷率。本文中共計有9例絨毛染色體核型結果未見異常，而芯片檢出染色體微缺失、微重復，4例為染色體微缺失，其中2例涉及16號染色體上微缺失，檢測為α-珠蛋白生成障礙性貧血，有研究稱，NT增厚對胎兒染色體異常、心臟畸形和重型α-珠蛋白生成障礙性貧血等多種異常有較好預測價值[12]；4例為染色體微重復，以及1例父源性9號染色體單親二倍體。故在核型分析的基礎上進行SNP-array檢測除了能避免胎兒染色體平衡重組、以及低比例嵌合及多倍體的漏診風險，對染色體核型明確診斷出來的非整倍體異常樣本，則需再行SNP-array檢測分析，為患者減輕經濟負擔。王敏等[13]發現，對NT異常的胎兒產前診斷可使用染色體核型分析聯合染色體微陣列檢測形式，可覆蓋染色體微缺失微重復，對產前診斷具有重要指導意義。NT增厚易致圍生兒死亡，有研究稱NT增厚的病例可預后不良，但仍有近一半NT增厚的病例在后期的隨訪消失，當排除胎兒染色體方面異常及結構異常，單純NT增厚仍然可健康存活[14-15]。

綜上所述，通過核型分析與SNP-array檢測能覆蓋大部分染色體的異常，SNP技術則對致病性CNV檢出有明顯優勢。但仍存不足，在染色體平衡易位、染色體倒位的檢測中具有不可替代的作用[16]。NT增厚作為產前檢測的重要指征，行常規染色體核型分析并行SNP分析，以獲得更多的遺傳學信息，為NT增厚預后評估及遺傳咨詢提供更優的臨床決策。