三代EGFR-TKI奧希替尼(AZD9291)耐藥細胞系建立及耐藥標志預測分析 *

苗留飛，楊 陽，余柏增，張家勛，李曉軍

(南京大學醫學院附屬金陵醫院/東部戰區總醫院中心實驗科，南京 210002)

肺癌位居我國惡性腫瘤發病首位[1]，約50%的亞洲非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)患者存在表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)敏感突變[2]，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)已經成為EGFR敏感突變陽性晚期NSCLC患者的一線治療藥物[3]。長期使用EGFR-TKI治療不可避免地產生獲得性耐藥[4-5]。第三代EGFR-TKI奧希替尼(osimertinib，AZD9291)針對EGFR T790M突變，被廣泛用于一代EGFR-TKI獲得性耐藥后替代治療[6]。AZD9291耐藥機制復雜多樣，未被完全明確，給臨床AZD9291耐藥后治療策略的選擇帶來困難。本研究通過自主構建AZD9291耐藥細胞系PC9-OR，生物信息學挖掘GEO數據庫耐藥細胞表達譜數據，篩選差異表達基因，構建耐藥預測模型并評估其診斷效能。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 PC9細胞系(購自上海吉凱基因化學技術有限公司)培養于含10 ml/dl胎牛血清(Gibco)RPMI 1640培養基(Gibco)中，置于37℃，5%(v/v)CO2、飽和濕度培養箱進行培養。

1.2 試劑和儀器 奧希替尼(AZD9291)購自Selleck公司；DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；RNA提取(RNA isoplus)、反轉錄、熒光定量(SYBR Green)試劑盒購自Takara公司；熒光定量PCR儀(ABI)；引物合成及Sanger測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 PC9細胞系驗證：天根細胞DNA提取試劑盒提取PC9細胞DNA，經相應18，19，20，21號外顯子引物PCR擴增后進行sanger測序，與參考序列比對。

1.3.2 奧希替尼耐藥PC9細胞系構建及細胞毒性實驗：奧希替尼起始濃度10 nmol/L，視細胞生長狀況隔兩周將藥物濃度翻倍，約5個月加至1 μmol/L，1 μmol/L維持兩周，CCK8檢測細胞IC50并計算耐藥指數RI(耐藥細胞IC50/親本細胞IC50)[7]。

1.3.3 利用qPCR技術檢測PC9和PC9-OR：首先RNAisoplus提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA后進行qPCR。以GAPDH為內參，利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3.4 數據挖掘及可能耐藥基因檢測：三代EGFR-TKI耐藥細胞表達譜芯片數據GSE106765[8]，GSE75602[9]和測序數據GSE103350。所有數據進行RMA標準化處理后經過log2對數轉化。分別用limma包和DEseq2包分析差異表達基因，FC>2倍且P<0.05被認為差異具有統計學意義。

1.3.5 耐藥signature的構建：利用logistics回歸構建多個基因聯合診斷的回歸模型，ROC曲線在獨立數據集GSE34228中評價模型診斷效能。

1.4 統計學分析 芯片和測序數據用R軟件分析處理，ROC曲線使用STATA軟件繪制，兩組之間計量數據使用studentttest檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PC9細胞系鑒定 測序顯示，PC9細胞EGFR基因19號外顯子5個氨基酸缺失(ΔELREA)。

2.2 三代EGFR-TKI耐藥細胞系構建 通過濃度梯度遞增加藥，構建了對奧希替尼耐藥的細胞系PC9-OR，見圖1。PC9的IC50=0.006 1 μmol/L，PC9-OR的IC50>10 μmol/L，耐藥指數大于1 639。

圖1 PC9和PC9-OR耐藥細胞的IC50

2.3 差異表達基因的篩選與qPCR驗證 利用GEO數據庫(GSE106765，GSE75602和GSE103350)，分析多個耐AZD9291細胞株差異基因，分別有47，372，45個表達上調基因。其中共同表達上調的3個，分別為MRAS，CTGF和ANKRD1。對在2個或者2個以上細胞數據中表達升高的基因進行熒光定量PCR驗證，結果顯示CTGF，MRAS，ANKRD1，IL32，DUSP1，CLIC4，PPBP和MCAM的表達上調顯著，見圖2A。同時已知的AZD9291耐藥基因FGFR1，FGF2和MET在我們構建的PC-OR中表達也升高，見圖2B。

A：不同數據集共同高表達基因RNA表達量；B：已知耐藥基因的RNA表達量。

(**P<0.01；***P<0.001)

圖2PC-9和PC9-OR細胞基因表達

2.4 EGFR耐藥性預測 獨立數據集GSE34228中用Logistic回歸構建不同高表達基因的耐藥預測模型，結果顯示，MRAS，MET，ANKRD1，MCAM和FGFR1具有較好的診斷效能，聯合診斷ROC曲線下面積達0.982 2，見圖3。

圖3 差異表達基因的ROC曲線

3 討論

長期使用AZD9291會出現腫瘤的獲得性耐藥，表現為出現EGFR下游信號分子RAS或BRAF激活突變[10-11]，Her-2及MET擴增旁路激活EGFR下游受體酪氨酸激酶[12]，Aurora kinase[13]，PIK3C[14]，FGF2-FGFR1自分泌環[15]以及轉化為小細胞肺癌[16]。

我們自主構建了三代EGFR-TKI奧希替尼耐藥細胞系PC9-OR。為了獲得非小細胞肺癌耐藥的共同基因特征，我們運用了多個AZD9291耐藥細胞的高通量測序及芯片數據整合分析[7-8]。在PC9-OR上進行了驗證，獲得了11個AZD9291耐藥細胞中高表達的基因。利用獨立的EGFR-TKI耐藥細胞株，我們發現ANKRD1，MET，MRAS，MCAM和TGFR1等5個高表達基因對三代EGFR-TKI耐藥具有較好地診斷效能，聯合診斷效能0.982 2。這五個基因可以作為EGFR-TKI耐藥的標志用于預測EGFR-TKI耐藥。

同時這些基因可以為下一步細胞學實驗驗證耐藥機制提供新的思路。MET是一個編碼酪氨酸激酶受體的原癌基因，其配體是肝細胞生長因子(human hepatocyte growth factor，HGF)，HGF/MET信號通路在組織損傷修復、促有絲分裂等過程中發揮重要作用，MET擴增激活了細胞內如PI3K-Akt，Ras-MAPK，STAT3等多種信號通路，可以介導對一代、三代EGFR-TKI耐藥[17]。MRAS編碼一個小GTPase的ras家族成員，這些膜相關蛋白在包括細胞生長和分化在內的多個過程中作為信號轉導物發揮作用，而ras信號的失調與許多類型的癌癥有關，其編碼蛋白可能在TNFα和MAPK信號通路中起作用[18]。錨蛋白重復域1(ankyrin repeat domain 1，ANKRD1)被報道與ZEB1共同參與了奧希替尼耐藥NSCLC細胞系PC9-OR，HCC827-OR細胞的EMT演變，還可能通過促進細胞bcl-2表達起到抗凋亡作用[9]。黑色素瘤細胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule，MCAM)又稱CD146，與部分細胞黏附分子有同源性，介導細胞黏附、維持細胞形態及調控細胞增殖、運動等。有報道MCAM通過上調干性相關基因、抑制β-catenin表達、促進細胞遷移和侵襲介導了一代EGFR-TKI獲得性耐藥[19]。可以激活下游很多信號級聯轉導分子，調控細胞發生與增殖等多種生物學過程，FGFR1擴增曾被報道介導了一例患者的奧希替尼獲得性耐藥[15]。

建立EGFR-TKI耐藥基因標志可以為預測腫瘤耐藥的發生提供依據，同時也可以為后期建立EGFR-TKI早期血清學標志奠定基礎。目前EGFR-TKI耐藥預測表型多基于體外耐藥細胞系[20]，由于有限的三代EGFR-TKI臨床樣本的數據，給耐藥機制和耐藥表型標志物的建立帶來了困難。本研究建立EGFR -TKI的耐藥預測基因集，結果顯示高表達耐藥基因特征的細胞具有EGFR-TKI抗性，能夠對EGFR-TKI耐藥有一定的提示作用。同時，腫瘤在體內的狀態具有更復雜的表型和局部微環境，盡管我們在多株EGFR-TKI耐藥細胞株上都獲得了驗證，但是由于腫瘤的異質性，我們需要進一步在腫瘤患者體內進行相關的驗證。