宮頸鱗癌患者癌組織Nemo樣激酶的表達與臨床病理特征及預后關系研究 *

蔣秋麗，王佩紅，苗群英，白 寧，樊陽陽

(1.漢中市中心醫院婦科，陜西漢中 723000；2.陜西省人民醫院婦產科，西安 710068)

宮頸癌是危害女性身心健康的重要疾病之一，其發病率僅次于乳腺癌，并位居女性生殖系統惡性腫瘤第二位[1]。每年在全球約有50萬新增宮頸癌患者，其中在中國新發病例約有13.15萬，占全球總發病人數的1/4[2]。根據組織病理特征，宮頸癌可以分為鱗狀細胞癌和腺癌，其中鱗狀細胞癌占宮頸癌全部組織類型的80%[3]。宮頸鱗癌5年生存率為70%[4]，嚴重威脅女性身體健康，并給患者帶來巨大經濟負擔[5]。由于宮頸癌早期發病隱匿，大多數患者就診時疾病已進展至晚期，因此尋找可以預示疾病進展的腫瘤標志物對宮頸癌的防治意義重大，也是宮頸癌相關臨床研究的熱點。

Nemo樣激酶(nemo-like kinase，NLK)是絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，與胞外信號調節激酶及細胞周期蛋白依賴性激酶同源。有研究報道，NLK在肝癌、結腸癌及前列腺癌的發生發展中扮演著重要的角色[6-8]。近年來，NLK與腫瘤細胞的增殖關系已成為腫瘤相關研究的熱點，但其在宮頸鱗癌發生發展中的研究尚未見報道。因此，本次研究的目的是探索宮頸鱗癌患者癌組織Nemo樣激酶的表達與臨床病理特征及預后關系，為宮頸鱗癌患者的診治及疾病預后的判斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 在2016年6月～2017年8月，共收集了172例于我院住院治療的宮頸鱗癌患者，所有病例均由病理診斷確診。所有納入患者均接受根治性子宮切除術和盆腔淋巴結切除術，且在術前均未接受過任何形式的化療及放療，僅部分高危患者接受了術后放療。本研究中所有患者均按照國際婦產科聯合會所推薦的標準(FIGO)進行術前分期[9]，并收集相關的臨床資料。本研究納入的患者年齡32～70歲，平均年齡為51.24歲；所有患者均采取門診或電話的方式進行長期隨訪。本研究中所有患者的隨訪中位時間達64個月(16～82個月)。用于評價患者預后的總體生存時間(overall survival time，OS)定義為術后至患者死亡經歷時間；無病生存時間(disease-free survival time，DFS)定義為手術成功完成至疾病復發所經歷時間，患者是否復發均需影像學及病理學證據判斷。本次研究報經本院倫理委員會審核批準，并且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 電泳槽，蛋白標準品，Western雜交儀，硝化纖維素濾膜購自伯樂生命醫學產品有限公司；倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司；NLK抗體，鼠二抗購自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 Western Blot將宮頸鱗癌病理組織置于RIPA緩沖液與1 mg/dl蛋白酶抑制劑混合溶液中4℃離心15 min。分離物采用雙鏈氨基酸蛋白試劑定量，隨后取30 μg蛋白質跑SDS-PAGE，而后轉移至甲醇活化的硝化纖維素濾膜。然后加入NLK抗體(1∶1 000稀釋)在4℃的條件下孵育過夜。加入二抗在室溫下靜置1 h，隨后曝光顯影。

1.3.2 免疫組化：將患者的病理組織石蠟標本切成4 μm的薄片并且用3 ml/dl的過氧化氫溶液在37 ℃的條件下處理30 min，隨后加入10 mmol/L的枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)并置于高壓鍋中2 min。與小鼠抗人NLK單克隆抗體(1∶100稀釋)4℃條件下靜置過夜孵育。加入鼠二抗，室溫孵育20 min。隨后將切片浸泡在3，3-四鹽酸二氨基聯苯溶液中并用蘇木紫復染。通過結合顯微鏡下陽性腫瘤細胞的染色強度及陽性腫瘤細胞百分比來評估NLK的免疫反應。染色結果由兩名10年以上病理科工作經驗的執業醫師獨立評價，當結果不一致時由第三名讀片人員進行讀片以確定最終結果。本次研究中，兩位讀片人員的讀片結果一致率為97.67%。染色百分比按照0%(0分)，<5%(1分)，5%～50%(2分)和>50%(3分)的評分標準進行；染色強度按照無染色(0分)，弱染色(1分)，中度染色(2分)和強染色(3分)的評分標準進行[10]。本次研究染色總得分在0～6分之間，總得分介于0～3分則認為NLK弱表達；總得分在4～6分則認為NLK強表達。

1.4 統計學分析 所有數據均采用SPSS19.0進行統計分析。采用χ2檢驗分析分類資料組間差異，定量資料則根據數據分布特征采用參數或非參數的方法分析組間差異。進一步采用Log-Rank檢驗比較不同組別患者總體生存時間(OS)及無疾病生存時間(DFS)的差異并繪制K-M生存曲線。應用COX模型探索NLK表達對總體生存時間(OS)及無疾病生存時間(DFS)的影響，首先逐一納入不同臨床特征因素，在α=0.05的水平下可以確定三個宮頸鱗癌患者總體生存時間的影響因素，分別為NLK表達情況、FIGO分期及淋巴結轉移。隨后，將三個因素共同納入模型中，當P<0.05時為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NLK表達情況與宮頸鱗癌患者臨床特征間的關系 見圖1。可以看出NLK染色主要集中在腫瘤細胞的細胞核。所有腫瘤組織標本中，有76例(44.19%)為NLK低表達；96例(55.81%)為高表達。39例淋巴結轉移的患者NLK處于高表達水平的有34例(87.18%)。

注：圖a為NLK在腫瘤組織中低表達時免疫組化染色結果；圖b為NLK在腫瘤組織中高表達時免疫組化染色結果；圖c為轉移性淋巴結組織中NLK高表達時免疫組化染色結果。

圖1宮頸鱗癌患者病理組織中NLK的表達情況

由表1可以看出，NLK的表達情況在不同年齡、不同FIGO分期、不同病理分級、不同腫瘤直徑及不同子宮旁組織累及狀態的人群間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。而NLK的表達情況在不同血管/淋巴結浸潤狀態、不同淋巴結轉移情況及不同腫瘤復發情況的人群間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 不同臨床特征研究對象NLK表達情況差異性分析[n=172，n(%)]

2.2 NLK表達與宮頸鱗癌患者預后的關系 見表2。NLK低表達水平的患者平均無疾病生存時間為76.41個月；NLK高表達水平的患者平均無疾病生存時間為53.24個月；Log-Rank檢驗結果提示NLK低表達水平患者與NLK高表達水平患者間無疾病生存時間的差異有統計學意義(P<0.001)；NLK低表達水平的患者總體生存時間為76.41個月，NLK高表達水平的患者總體生存時間為56.05個月；Log-Rank檢驗結果提示NLK低表達水平患者與NLK高表達水平患者間總體生存時間的差異有統計學意義(P=0.005)。見表3。可以看出患者的NLK表達情況、FIGO分期及淋巴結轉移均是影響患者總體生存時間的風險因素。進一步進行患者無疾病生存時間的影響因素分析，可以看出患者的NLK表達情況及淋巴結轉移均是影響患者無疾病生存時間的危險因素。

圖2 NLK表達量對宮頸鱗癌患者總體生存時間以及無疾病生存時間的影響

表2 不同NLK表達情況患者生存時間差異性分析

表3 COX模型危險因素分析及因素HR估計

3 討論

本研究發現，NLK的表達與患者淋巴/血管浸潤、淋巴結轉移及疾病復發情況有密切關系；COX模型的結果同時表明NLK的表達情況是整體生存時間及無疾病生存時間的獨立影響因素。總之，本次研究發現NLK可以作為預示宮頸鱗癌患者進展及預后的指標。通過對已有文獻的查閱可以發現，NLK的表達在不同類別腫瘤的細胞中不同。其中，NLK在60%～70%的COS7細胞及HEK293細胞中主要在細胞核中表達，在30%～40%的細胞中主要表達在細胞質中[10]。分析鼻咽癌、肝細胞癌、膠質瘤及膽囊癌的病理組織，發現NLK主要在細胞核表達，在直結腸癌中NLK主要表達在細胞質[10-13]。在本研究中發現宮頸鱗癌患者中NLK的表達主要集中在細胞核。NLK在不同腫瘤細胞中表達位置的不同可能表明NLK在不同腫瘤中通過不同的信號傳導通路參與腫瘤細胞生理過程的調節。

有證據表明，NLK既是原癌基因又是抑癌基因，這主要與器官/細胞類型有關。一方面，NLK作為致癌基因，下調該基因的表達可能抑制癌癥的發展。研究發現抑制NLK的表達可以減緩肝癌的細胞生長并增加負向調節細胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達，達到延緩肝癌惡化的作用[14]；此外，下調NLK的表達可顯著降低膽囊癌細胞的增殖和遷移能力[11]。另一方面，NLK可通過抑制細胞增殖、遷移、侵襲或誘導細胞凋亡來抑制癌癥的發展。上調NLK的表達可以抑制雄激素受體介導的轉錄并減少前列腺癌細胞PC-3的數量[8]。在人結直腸腺癌上皮細胞中NLK的過度表達可誘發細胞凋亡，抑制細胞增殖[15]。本次研究發現，宮頸鱗癌病理組織中NLK的表達主要體現為致癌的作用，但還需進一步的細胞試驗加以證實，這也是下一步研究的方向。

總而言之，本次研究發現NLK的過度表達在宮頸鱗癌的發生、發展中起著重要的作用并且與患者預后有密切的關系。NLK高表達水平的患者復發風險及死亡風險均較高，這對宮頸鱗癌患者的隨訪、治療及預后的判斷有重要意義，這也進一步表明通過抑制NLK的過表達可能成為延緩宮頸鱗癌病程發展的方法。