長(zhǎng)鏈非編碼RNA ZEB1-AS1在兒童腦腫瘤中表達(dá)及對(duì)化療藥物敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究 *

曹 玲

(榆林市第一醫(yī)院新生兒病區(qū)，陜西榆林 719000)

兒童惡性腫瘤嚴(yán)重危害兒童健康[1-2]，全球兒童惡性腫瘤發(fā)病出現(xiàn)逐年遞增的惡性趨勢(shì)[3-4]，死亡率居高不下[5]，我國(guó)兒童惡性腫瘤防治與西方發(fā)達(dá)國(guó)家相比有顯著差距[6-8]。兒童惡性腫瘤給家庭及社會(huì)帶來(lái)了巨大的傷害和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性兒童腦腫瘤是兒童惡性腫瘤致死的主要原因[12-13]，兒童腦腫瘤發(fā)病高峰期為4～9歲，其診治與成人腫瘤具有較大差異[12]。且近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在患兒化療過(guò)程中出現(xiàn)耐藥的趨勢(shì)，故亟待尋找新的腫瘤標(biāo)志物，特別是耐藥相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物[14]，探索兒童腦腫瘤耐藥的新機(jī)制對(duì)兒童腦腫瘤的治療和預(yù)后有重要意義。本研究通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA) lnc-ZEB1-AS1 (Zinc finger E-box Binding homeobox 1 Antisense RNA 1，ZEB1-AS1)在兒童腦腫瘤中高表達(dá)，本研究將對(duì)其在兒童腦腫瘤耐藥過(guò)程中所起作用進(jìn)行以下研究。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究所用到的18例兒童腦腫瘤組織標(biāo)本于2016年1月～2018年9月收集于榆林市第一醫(yī)院，其中男性11例，女性7例，平均年齡4.1±2.2歲?；颊咧g不存在親緣關(guān)系。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)買自TAKARA公司(日本)，DEPC水(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)、lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑、順鉑和5-FU均購(gòu)買自Invitrogen(美國(guó))，CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑購(gòu)買自APExBIO公司(美國(guó))。

1.2.2 儀器：ABI 7500 PCR儀購(gòu)買自ABI公司(美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：人CHG-5細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基采用含10 ml/dl FBS+1 ml/dl雙抗的1640培養(yǎng)液，5%(v/v)CO2，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)。

lnc-ZEB1-AS1干擾及其對(duì)照DEPC水溶液根據(jù)上海生工操作手冊(cè)說(shuō)明配置。細(xì)胞接種24 h，細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑采用lipofectamine 3000，細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作步驟按life technologies公司說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染8 h后換液，待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)：取上述轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHG-5細(xì)胞，常規(guī)消化制成細(xì)胞懸液后按200 cell/well濃度接種于96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)平行孔，并按檢測(cè)時(shí)間設(shè)置(0，24，48，72，96 h)共計(jì)5個(gè)平行96孔板。常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)前使用PBS清洗細(xì)胞3次后加入新鮮培養(yǎng)液，并按要求加入CCK-8試劑，檢測(cè)其450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，并比較各組差異。

1.3.3 化療藥物敏感性實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用加入化療藥物(順鉑和5-FU)后檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況差異來(lái)分析lnc-ZEB1-AS1不同表達(dá)水平下對(duì)化療藥物敏感性的差異。

實(shí)驗(yàn)中，取胰蛋白酶消化重懸后的細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)平行孔；按對(duì)數(shù)濃度梯度設(shè)置化療藥物(5-FU，順鉑)的濃度梯度加藥，常規(guī)培養(yǎng)24 h后PBS清洗96孔培養(yǎng)板，加入含20 ml/dl CCK-8試劑的培養(yǎng)液，2 h后在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度值，吸光度值愈高則表示孔內(nèi)細(xì)胞越多。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)：取上述轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)消化處理成細(xì)胞懸液。按2×104cell/well接種于小室中，小室上層使用無(wú)血清高糖培養(yǎng)液，下層使用含20 ml/dl胎牛血清的高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后使用多聚甲醛固定后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，并使用顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)步驟相同，僅侵襲實(shí)驗(yàn)所使用的小室為預(yù)先鋪設(shè)基質(zhì)膠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平的差異。使用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析細(xì)胞遷移和侵襲能力差異；采用重復(fù)測(cè)量的方差分析方法分析細(xì)胞增殖能力的差異(CCK-8實(shí)驗(yàn)及化療藥物敏感性實(shí)驗(yàn))。統(tǒng)計(jì)過(guò)程使用實(shí)驗(yàn)SPSS19.0軟件運(yùn)行，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，α=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 ZEB1-AS1在兒童腦腫瘤中高表達(dá)

2.2 干擾lnc-ZEB1-AS1抑制腫瘤細(xì)胞增殖 本研究通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了干擾lnc-ZEB1-AS1后對(duì)CHG-5細(xì)胞增殖能力的影響。通過(guò)重復(fù)測(cè)量的方差分析，結(jié)果顯示：當(dāng)細(xì)胞增殖48 h以后，干擾組細(xì)胞增殖速度明顯較對(duì)照細(xì)胞低。

轉(zhuǎn)染后0，24，48，72和96h分別在450 nm下的吸光度值(A值)，分別為干擾組vs對(duì)照組(時(shí)間，P干擾vs對(duì)照)：0.337±0.009 vs 0.339±0.029(0 h，P>0.05)，0.350±0.017 vs 0.360±0.029(24 h，P>0.05)，0.487±0.040 vs 0.545±0.028(48 h，P=0.044)，0.548±0.061 vs 0.678±0.055(72 h，P=0.013)和0.718±0.035 vs 0.899±0.073(96 h，P=0.002)，見(jiàn)圖2。通過(guò)以上數(shù)據(jù)可見(jiàn)在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期以前，干擾ZEB1-AS1能夠明顯抑制CHG-5細(xì)胞的增殖。

(*P<0.05，**P<0.01)

2.3 干擾lnc-ZEB1-AS1增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性 通過(guò)改進(jìn)CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了干擾lnc-ZEB1-AS1后宮頸癌細(xì)胞對(duì)常見(jiàn)化療藥物5-FU和順鉑敏感度的影響。

其中，干擾組對(duì)5-FU的IC50為14.72±3.89 μmol/L，對(duì)照組對(duì)5-FU的IC50為3.15±0.89 μmol/L(P<0.01)；干擾組對(duì)順鉑的IC50為53.26±6.36 μmol/L，對(duì)照組對(duì)順鉑的IC50為8.23±1.65 μmol/L(P<0.01)。兩種化療藥物處理后細(xì)胞的存活曲線見(jiàn)圖3。兩種藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示：過(guò)表達(dá)組細(xì)胞對(duì)5-FU及順鉑的敏感度降低，提示干擾ZEB1-AS1能夠增加CHG-5細(xì)胞對(duì)5-FU及順鉑的敏感度。

(*P<0.05，** P<0.01)

2.4 干擾lnc-ZEB1-AS1的表達(dá)后將抑制CHG-5細(xì)胞遷移和侵襲 本研究通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了干擾lnc-ZEB1-AS1后對(duì)CHG-5細(xì)胞遷移能力的影響。通過(guò)吉母薩染色后顯微鏡下拍照(200×)計(jì)數(shù)后分析發(fā)現(xiàn)：干擾組CHG-5細(xì)胞遷移能力明顯較對(duì)照細(xì)胞減少：干擾vs對(duì)照：93.4±6.7 vs 51.2±9.4，P<0.001，見(jiàn)圖4A，B。本研究通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了干擾lnc-ZEB1-AS1后對(duì)CHG-5細(xì)胞侵襲能力的影響。通過(guò)吉母薩染色后顯微鏡下拍照(200×)計(jì)數(shù)后分析發(fā)現(xiàn)：干擾組CHG-5細(xì)胞侵襲能力明顯較對(duì)照細(xì)胞減少：干擾vs對(duì)照：64.1±6.3 vs 31.1±4.2，P<0.01，見(jiàn)圖4C，D。

(A：遷移照片200×；B：遷移數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；C：侵襲照片200×；D：侵襲數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì))

3 討論

我國(guó)兒童惡性腫瘤疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，且發(fā)病率逐年上升[11-13]，給國(guó)家和患者家庭都帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9]。兒童惡性腫瘤發(fā)病率主要在4～9歲[12]，其主要原因是兒童神經(jīng)系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，容易忽略疾病早期癥狀[15-16]，兒童實(shí)體腫瘤發(fā)病約占所有兒童惡性腫瘤的2/5，稍低于白血病和淋巴瘤，其中兒童腦腫瘤主要為原發(fā)性腫瘤，以先天性腫瘤和膠質(zhì)瘤最為常見(jiàn)[17]。目前對(duì)于兒童實(shí)體腫瘤的治療以手術(shù)為主，放化療為輔，但是由于腫瘤確診時(shí)有較多病例已發(fā)展為終末期，已不適合手術(shù)治療的情況下化療出現(xiàn)耐藥[18-19]，而當(dāng)前對(duì)兒童腦腫瘤化療耐藥機(jī)制尚未有深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)在敲低lnc-ZEB1-AS1后CHG-5細(xì)胞增殖受到抑制，且遷移和侵襲能力也同樣受到抑制；研究者通過(guò)檢測(cè)干擾lnc-ZEB1-AS1后CHG-5細(xì)胞對(duì)5-FU和順鉑的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)敲低lnc-ZEB1-AS1后CHG-5細(xì)胞對(duì)上述兩種化療藥物的敏感性較對(duì)照組明顯增加。上述研究結(jié)果與LI等[20-21]在膀胱癌中的研究結(jié)果類似，其研究發(fā)現(xiàn)lnc-ZEB1-AS1在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，且對(duì)化療敏感性降低。CHENG等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)lnc-ZEB1-AS1通過(guò)和ZEB1基因相互作用，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲和間充質(zhì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。FU等[24-26]幾個(gè)研究均發(fā)現(xiàn)lnc-ZEB1-AS1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后相關(guān)。JIN等[27]報(bào)道lnc-ZEB1-AS1高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后相關(guān)，且能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移并影響其細(xì)胞周期。另有研究報(bào)道lnc-ZEB1-AS1與肝癌、胃癌、骨肉瘤等[28-32]多種腫瘤相關(guān)。

在腦腫瘤中，LU等[33]研究發(fā)現(xiàn)lnc-ZEB1-AS1能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞癌變，與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后相關(guān)；MENG等[34]研究發(fā)現(xiàn)lnc-ZEB1-AS1通過(guò)調(diào)控miR-200c/141-ZEB1軸導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)?。籛EI等[35]發(fā)現(xiàn)lnc-ZEB1-AS1通過(guò)與miR-577作用促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。以上研究均表明lnc-ZEB1-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中發(fā)揮促癌基因的作用，但是目前尚未見(jiàn)到其在兒童腦腫瘤耐藥機(jī)制上的研究。本研究發(fā)現(xiàn)干擾lnc-ZEB1-AS1后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性升高。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lnc-ZEB1-AS1在兒童腦腫瘤中高表達(dá)，且通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其低表達(dá)后對(duì)化療藥物的敏感性增加，但是尚未對(duì)lnc-ZEB1-AS1介導(dǎo)兒童腦腫瘤耐藥的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，是本研究的不足之處。