烏魯木齊漢族婦女亞甲基四氫葉酸還原酶基因變異與血清葉酸和同型半胱氨酸水平的相關性研究 *

張 燕，王偉紅，郝萬鵬

(1.烏魯木齊市第一人民醫院檢驗科，烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市溫泉康復醫院，烏魯木齊 830017)

亞甲基四氫葉酸還原酶全稱為5.10-亞甲基四氨葉酸還原酸酶(methylenetetrarydrofo-late reductase，MTHFR)，為葉酸(folic)與同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代謝通路的關鍵酶，從而維持了血液中Hcy的濃度；另一方面還參與體內嘌呤、嘧啶的合成及DNA，RNA蛋白質的甲基化。MTHFR基因位點發生突變，其變異直接影響酶的活性，引起MTHFR酶活性下降，使Hcy向蛋氨酸的轉化發生障礙，引起高同型半胱氨酸血癥。影響葉酸的整個代謝過程。有學者研究報道，rs1801133(C677T)這個位點與人類疾病的關聯更為緊密，這個位點的多態性在不同人群、不同種族中的分布不一致，在全球范圍內的變異頻率較高，不同地區有較大差異[1-2]。還有文獻報道，異常的葉酸代謝可能導致引起高同型半胱氨酸血癥，從而導致多種疾病的發生。產生胎盤毒性等機制導致不良妊娠結局(包括自然流產、早產、異位妊娠、胚胎停育、死胎、先天性心臟病、出生缺陷等)的發生。MTHFR基因C677T多態性位點可能是導致不良妊娠高風險的因素之一[3]。據此，本文利用2018年1月～2019年1月來本院進行孕前或孕期體檢的MTHFR位點TT基因型的育齡婦女作為觀察組研究對象。另選擇非MTHFR位點TT基因型者的健康育齡婦女作為對照組研究對象，兩組研究對象皆在我院產科分娩。研究兩組不良妊娠結局的發生頻率，同時分析葉酸與Hcy兩者濃度的變化及相關性，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月～2019年1月期間在我院進行孕前與孕期檢查且在我院分娩的漢族育齡女性。選擇觀察組，排除不符合要求、籍貫非本市者，共110例，年齡在20～35歲，平均年齡30.5±5.1歲。全部為MTHFR C677T位點TT基因型。對照組納入標準：非MTHFRC677T位點TT基因型者，生育史正常，無不良妊娠史及家族性遺傳病史，無甲亢及糖尿病等內分泌病史，新生兒健康。年齡在19～34歲之間，平均年齡29.1±4.1歲，在年齡、血壓、BMI方面，差異無統計學意義(P>0．05)。在我院進行孕前與孕期檢查且在我院分娩的漢族育齡女性118例。進行回顧性研究。

1.2 儀器與試劑 基因測定：PCR基因擴增儀(蘇州市天隆科技有限公司)。MTHFRC677T基因檢測試劑盒(西安金磁納米生物技術有限公司)。Hcy測定：全自動生化分析儀(羅氏公司7600型)，試劑盒為北京九強科技有限公司產品。葉酸測定：化學發光分析儀(羅氏公司E602型)，試劑盒為羅氏公司配套產品，批號332978。

1.3 方法

1.3.1 樣品收集：對所有受檢查者空腹抽取外用靜脈血2 ml于EDTA抗凝管，另取5 ml于分離膠采血管。

1.3.2 MTHFRC677T基因檢測：檢測項目為MTHFRC677T位點。樣品為收集的2 ml EDTA抗凝血，通過側向層析技術實現MTHFRC677T基因多態性的檢測。具體參數及操作方法參照PCR擴增儀及試劑盒說明書進行。

1.3.3 血清Hcy測定：將5 ml分離膠采血管離心分離血清，儀器使用羅氏7600全自動生化分析，試劑使用北京九強循環法試劑盒，按照儀器與試劑說明書操作步驟進行Hcy檢測。Hcy正常參考范圍為5～15 μmol/L。

1.3.4 血清葉酸測定：將測定Hcy分離的血清，使用羅氏E602全自動化學發光分析儀，廠家配套試劑盒(批氏E602號332978)，按照說明書進行操作，正常參考范圍為7.5～20.1 μg/L。

1.5 質量控制 所使用儀器每年進行一次計量檢測，均須合格。所使用試劑均有注冊證。Hcy及葉酸測定參加了國家衛健委臨床檢驗中心室間質評。測定樣品時均做室內質控，在控時才可檢測。

2 結果

2.1 MTHFRC677T位點TT基因型Hcy與葉酸濃度 見表1。MTHFRC677T位點TT基因型者，葉酸濃度降低，Hcy濃度升高，葉酸與Hcy濃度兩組比較，差異均具有統計學意義(P=0.000)。

項 目觀察組(n=110)對照組(n=118)t值P值Hcy(μmol/L)葉酸(μg/L)25.9±2.94.9±2.610.5±1.815.5±1.99.8358.3560.0000.000

2.2 MTHFRC677T位點TT基因型不良妊娠結局者與正常人群的比較 在110例TT基因型觀察組中，發生不良妊娠結局者21例，發生頻率為19.1%，而對照組118例中，發生不良妊娠結局者只有5例，發生頻率4.2%。兩組數據經計數資料卡方檢驗，差異均有統計學意義(χ2=29.3，P=0.000)，兩組差異具有統計學意義，MTHFRC677T位點TT基因型不良妊娠結局發生頻率高于對照組。

2.3 Hcy與葉酸的相關性 見圖1。對兩組數據進行Pearson相關分析，結果顯示Hcy與葉酸呈顯著負相關，相關系數r=-0.859，回歸方程為：Y=-0.785X+0.913。以葉酸為Y軸，以Hcy為X軸，做散點圖，進行相關性分析，兩組數據差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 MTHFR基因分布頻率及分布特點 烏魯木齊地區育齡婦女MTHFRC677T位點TT基因型頻率為24.5%(110/449)。與相關文獻報道[4]的烏魯木齊地區漢族女性MTHFR677T純合突變基因型頻率24.1%(52/216)相接近。高于惠州(10.9%，39/359)，柳州(9.2%，24/260)等[5，9]地區，差異有統計學意義(χ2=39.3，45.9，均P=0.000)；與銀川(23.0%，102/443)，延安(26.7%，403/1 508)，鎮江(21.8%，630/2 885)等[6-8]地區比較，差異無統計學意義(χ2=0.18，P=0.983；χ2=5.21，P=0.74；χ2=2.16，P=0.361)。

圖1 Hcy與葉酸相關性散點圖

3 討論

3.1 MTHFRC677T基因多態性是第677位點突變，它是目前發現最常見的基因突變位點，該位點的變化是堿基胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置換，這種功能性的突變直接影響MTHFR酶的活性和耐熱性。該位點突變有3種基因型：野生型CC，雜合突變型CT，純合突變型TT。TT型的活性僅為CC型的30%，加熱5 min后，CT型酶活性為56%，而TT型酶活性僅為22%， CC型作為對照組剩余酶活性為67%[1]。中國漢族人群C677T的突變頻率為40%，MTHFRC677C等位基因頻率分布呈現地理梯度，突變頻率隨著緯度的增加先增加再減少。TT型基因頻率在南方地區為6.6%，中部地區為14.2%，北部地區為21.3%，最北部地區為15%。MTHFR位點的多態性可能會引發孕婦妊娠高血壓，而且與不明原因反復自然流產也有關(TT型基因)，也增加胎兒心臟畸形的發生率，同時增加伴隨先天性心臟病的先天愚型(也稱唐氏綜合征)患兒的出生率。也是引起流產或使胎兒生長受限等的原因。由于與孕婦疾病及出生缺陷的相關性，MTHFR位點已被列入計劃生育常規體檢項目，女性在懷孕期間最好進行“孕期葉酸需求”基因檢測。

3.2 葉酸是合成核酸必不可少的元素之一，但是不能在人體內合成，因此必須從外界獲取。葉酸代謝是一個復雜的生化過程。在葉酸代謝過程中，涉及到的一些酶具有多態性。由于個體遺傳差異因素的存在，MTHFR基因發生突變者，就導致對葉酸的利用率降低，使孕婦補充等量葉酸后，但是體內的葉酸活性存在差異。研究表明，MTHFR基因多態性是葉酸代謝障礙發生的重要因素[10]。

3.3 Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的一個中間產物，損傷血管內皮細胞。血清Hcy水平亦是心腦血管疾病的獨立危險因素。高同型半胱氨酸血癥嚴重影響血管增殖和相應的修復功能，從而引發孕婦體內胎兒發生血管病變和凝血系統障礙等，故必須保持體內Hcy濃度處于平衡狀態。葉酸代謝相關酶活性正常，才能維持體內Hcy水平。影響Hcy代謝的因素主要有環境和遺傳兩個方面。遺傳因素方面，有文獻報道，MTHFR基因的677位點突變后，血清中Hcy濃度會顯著升高。在MTHFR患者中，帶有TT基因型的患者血清中Hcy濃度明顯高于CC基因型患者。孕婦檢測MTHFR基因C677T位點基因型，并結合血清Hcy濃度測定，有助于預防出生缺陷的發生。