人血清淀粉樣蛋白A磁微粒化學發光免疫分析定量檢測方法的建立及性能評價 *

丁蒙蒙，李 奎，于 林，李雙法

(鄭州安圖生物工程股份有限公司，鄭州 450016)

血清淀粉樣蛋白A(human serum amyloid A，SAA)是1976年從血清中分離鑒定出的一類高度保守的急性期蛋白家族成員，也是一種存在于血漿中的脂結合蛋白[1]。通常被認為是炎癥反應的主要蛋白之一[2]，人體內正常情況下SAA含量是極低的，在細菌或病毒感染時迅速升高。近年來的研究結果表明：SAA在細菌、病毒感染，慢性炎性(類風濕性關節炎、糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺疾病)，腫瘤等疾病中均有升高，與傳統的感染標志物外周血白細胞計數(peripheral blood white blood cell count，WBC)和C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)相比，SAA的優勢在于病毒感染期靈敏度高，升高時間較其他標志物早，而且升高幅度大[3]。因此在感染早期，SAA聯合CRP檢測，能提高鑒別細菌或病毒感染的可靠性[4-5]。目前用于檢測SAA的方法主要有透射比濁法、散射比濁法、乳膠增強免疫比濁法和酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunoSorbent assay，ELISA)，關于磁微粒化學發光法未見報道，因此本研究旨在建立一種快速、準確檢測SAA的磁微粒化學發光法，并對其檢測性能進行研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取駐馬店中心醫院2018年5～10月疑似細菌或病毒感染患者300例，100例來自正常人體檢樣本。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：基因工程重組SAA抗原、抗SAA小鼠單克隆抗體對(SAA1，SAA2)購自鄭州伊美諾生物技術有限公司；校準品稀釋液為50 mmol/L pH 7.4 TB緩沖液，含有1 mg/dl Casein，0.2 ml/dl P-300；磁珠包被緩沖液為20 mmol/L pH 7.4 PBS緩沖液；封閉液為50 mmol/L pH 7.4 TBS緩沖液，含有2 mg/dl BSA，0.2 ml/dl P-300；對比試劑：西門子試劑盒，血清淀粉樣蛋白A(散射比濁法)測定試劑盒；SAA國際標準品(NIBSC 92/680)購買自英國NIBSC公司。

1.2.2 主要儀器：Auto Lumo A2000 Plus全自動化學發光測定儀(鄭州安圖生物工程股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 雙抗體夾心法抗體制備

1.3.1.1 包被抗體的制備：取磁珠包被緩沖液300 μl，加入300 μg的磁珠原液反復吹打，置于磁珠分離器上吸取上清后，添加碳二亞胺活化液，室溫反應30 min～1 h，然后加入鼠抗人SAA捕獲抗體偶聯2 h或過夜，偶聯結束后，置于磁珠分離器上吸取上清，加入乙醇胺溶液進行封閉30 min，吸取上清后加入封保液，混勻后置于磁珠分離器，棄上清，重復3～5次后，最后加入封保液定容至3 ml，置于2～8℃保存。

1.3.1.2 辣根過氧化物酶標記SAA抗體的制備：采用過碘酸鈉法標記SAA抗體并用半飽和硫酸銨法純化并透析，取上清加入50ml/dl甘油于-20℃保存。

1.3.2 SAA校準品的制備：使用校準品稀釋液稀釋SAA國際參考品(NIBSC 92/680)，濃度分別為200，100，50，25，5mg/L，校準品稀釋液為0 mg/L，同時SAA校準品高點濃度為200 mg/L。

1.3.3 試劑盒的性能指標

1.3.3.1 空白限：準備5份接近0值的臨床樣本，每個樣本重復3次，連續測定4天，按照CLSI EP17-A2的方法進行結果分析，計算空白限。

1.3.3.2 精密度：

1.3.3.2.1 分析內變異：分析內變異是指在同一次分析測定中測定結果的變異情況。按照CLSI EP5-A2的方法分別準備臨床精密度樣本高、中、低濃度三份，各重復測定20次，計算分析內變異。

1.3.3.2.2 分析間變異：分析間變異(也叫天間變異)是指在不同次的分析測定中測定結果的變異情況。按照CLSI EP5-A2的方法，制備臨床精密度樣本高、中、低濃度3份，每天各檢測2次，每次2個重復，連續檢測20天，計算分析間變異。

1.3.3.3 線性：根據CLSI EP06-A文件進行線性范圍的建立。具體方法如下：準備10份濃度約為300 mg/L的臨床高值樣本和1份濃度接近于0的臨床低值樣本按照不同比例混合，制備出10組系列濃度的樣本，作為線性樣本進行測定，計算線性范圍。

1.3.3.4 準確度：用標準品稀釋液稀釋國際標準品，稀釋到線性范圍內的3個濃度樣本。每個樣本重復檢測2次，計算每個樣本檢測濃度與理論濃度的偏差。

1.3.3.5 回收率：根據CLSI EP09文件進行試劑盒的回收率評估。具體方法如下：選擇高值樣本3份，按照1∶9的比例分別加入到3份低值樣本/基質樣本中，制成回收樣本，加入高值樣本的體積不得超過總體積的10%，每個回收樣本重復檢測3次求均值，計算回收率。回收率R=[ C×(V0+VS)-C0×V0]/(CS×VS)×100% ，其中V0為低值樣本的體積，VS為高值樣本的體積，C為回收樣本的檢測濃度，C0為低值樣本的檢測濃度，CS為高值樣本的檢測濃度。

1.3.3.6 鉤狀效應：將SAA抗原加入SAA校準品稀釋液中，配制成系列梯度HOOK樣本(理論濃度分別為10 000，8 000，4 000，2 000 mg/L)進行測定。

1.3.3.7 方法學比對：根據CLSI EP09-A2文件，與對比試劑均在相同條件下進行平行檢測，具體方法如下：分別用本文方法和西門子檢測系統(散射比濁法)同時進行檢測，每份樣本重復3次檢測，計算均值，并進行線性擬合和統計學分析。

1.4 統計學分析 線性擬合采用Excel軟件進行，性能評價按照EP文件的實驗要求，實驗結果采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1 空白限 對得到的60個數據進行分析，該檢測方法的空白限為0.1 mg/L。

2.2 精密度 見表1。該方法學的分析內精密度均不高于5%，分析間精密度不高于10%。

2.3 線性 10組回歸方程的相關系數r均大于0.990，10組樣本中每個樣本的實際測得濃度與理論濃度的相對偏差均小于2%，因此本研究建立的SAA檢測方法的線性范圍為2～200 mg/L。

2.4 準確度 用標準品稀釋液稀釋國際標準品，得到線性范圍內的3個濃度樣本。3個稀釋樣本的實測濃度與理論濃度的偏差分別為5.18%，4.94%和6.64%，其偏差均小于試劑盒允許偏倚15%。

2.5 回收率 見表2。10個樣本的回收率在95%～114%之間，符合要求。

表1 分析內、分析間精密度檢測結果

表2 回收率的測定(mg/L)

2.6 鉤狀效應 對濃度為10 000 mg/L的樣本進行測定，結果顯示其信號值回算的濃度值均大于200 mg/L，說明采用本方法學檢測，樣本中SAA濃度高達10 000 mg/L時，未出現鉤狀效應。

2.7 方法學比對 兩種方法同時檢測100例臨床血清(其中60例為細菌或病毒感染患者血清，40例為正常人血清)進行SAA測定，以西門子試劑SAA檢測值為X軸，以安圖磁微粒化學發光試劑SAA檢測值為Y軸，線性回歸方程為：Y=1.099 8X-2.673 9，相關系數(r2)為0.983 4，見圖1。

圖1 相關性擬合曲線

3 討論

SAA屬于一種急性時相反應蛋白，人體中主要在肝臟中合成，在急性時相反應中，由白細胞介素1(interleukin，IL-1)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α) 刺激誘導產生，這些細胞因子可以與糖皮質激素協同作用以增強SAA的產生[6]。SAA是反映感染性疾病早期炎癥的重要指標，在炎癥或感染急性期48～72 h內迅速升高，并在疾病的恢復期下降，與CRP相比，具有更高的敏感性[7]。現有的研究結果表明，SAA參與了多種疾病如心腦血管疾病、細菌、病毒感染、動脈粥樣硬化、冠心病、急性移植排斥反應、腫瘤、類風濕性關節炎等，并在疾病的發生和發展中起著重要的作用。因此，SAA磁微粒化學發光法的建立具有重要的意義。

SAA檢測方法主要包括免疫比濁法、膠體金法、ELISA，熒光層析法等[8]。免疫比濁法由于儀器的要求高以及原理的缺陷，造成免疫比濁法的檢測結果線性短，檢測結果不準確，而且易受血脂的影響。膠體金法適用于床旁檢驗，并且可以檢測全血，但該方法不利于樣本批量處理。ELISA測定具有較高的靈敏度，但操作過程繁瑣，每次測值均需要繪制標準曲線，準確度誤差大，測定時間較長，儀器昂貴且需要經過一定專業培訓的人員進行操作。化學發光法作為新一代標記免疫測定方法具有高靈敏度、高精密性、易操作等優點，可以很好地滿足臨床科室對感染性疾病快速、準確診斷的需求。

本研究采用磁微粒化學發光免疫檢測法，基于雙抗夾心法原理，搭配全自動免疫檢測儀，靈敏度高、精密度好、線性范圍寬、臨床相關性好，具有一定的臨床應用價值。